Auteur: M. Franssen
Promotiejaar: 2004
Samenvatting
1. Van kliniek naar transit amplifying cel
De belangrijkste doelstelling van dit proefschrift was het bestuderen van aspecten van differentiatie en proliferatie in de psoriatische epidermis (deel 1 en 2) en meer specifiek in het germinatieve compartiment van de psoriatische epidermis (deel 3) met een bijzondere aandacht voor het compartiment van de transit amplifying cellen. De Engelse term “transit amplifying cell” beschrijft een celtype dat voortkomt uit de stamcel van – in dit geval – de epidermis en in korte tijd het aantal gedifferentieerde keratinocyten afkomstig van een stamceldeling aanzienlijk kan uitbreiden (amplificeren). In de literatuur ziet men zowel de term “transit” als “transient” voorkomen; beide termen zijn juist maar geven een ander aspect van dit celtype weer. “Transit” duidt op het feit dat deze cellen de fase tussen en stamceldeling en de terminaal gedifferentieerde keratinocyt beslaan, terwijl “transient” duidt op hun korte en voorbijgaande proliferatieve activiteit. In dit proefschrift werd de voorkeur gegeven aan de term transit amplifying cel. Aangezien er geen Nederlandse vertaling voor deze term bestaat zal de Engelse naam voor dit celtype aangehouden worden. In hoofdstuk 1 wordt beschreven dat de etiologie van psoriasis nog niet geheel opgehelderd is en ondanks dat men momenteel aanneemt dat de T cel hierin centraal staat [1-2], zijn er nog steeds aanwijzingen dat ook de keratinocyt een belangrijke rol in het ziekteproces heeft [3-7]. Een recente studie naar proliferatieve celpopulaties in de epidermis van de muis toonde aan dat de transit amplifying celpopulatie een hoger aantal delende cellen vertoont dan de stamcelpopulatie. Er werd ook gevonden dat in de dikkere epidermis op de voetzool van de muis meer transit amplifying cellen in de S-, G2- of M-fase van de celcyclus zaten. Dit suggereert dat er een correlatie bestaat tussen het celcyclusprofiel van transit amplifying cellen en zowel de dikte als de proliferatieve staat van de epidermis. In andere woorden; transit amplifying cellen zouden de celpopulatie kunnen zijn die direct verantwoordelijk is voor het aantal cellagen en de algehele proliferatieve staat van het weefsel waarin zij verblijven [8]. Dit is een interessante suggestie wanneer men naar de psoriatische epidermis kijkt; deze kenmerkt zich namelijk niet alleen door een uitgesproken hyperproliferatie, maar ook door een toename in het aantal cellagen. Niettemin is het exacte mechanisme achter de celcyclusregulatie van de transit amplifying cellen, maar ook de epidermale stamcel nog steeds een moeilijk vraagstuk dat vele onderzoekers bezighoudt en een uitgebreid onderzoeksterrein beslaat.
De regulatie van de celcyclus in de epidermis is zeer complex en om homeostase te kunnen behouden of adequaat te kunnen reageren op een situatie, moeten vele momenten in dit proces goed gecontroleerd worden: de snelheid van een stamceldeling, het feit of een stamceldochter een stamcel blijft of zich tot een meer gedifferentieerde transit amplifying cel ontwikkelt, het aantal celdelingen dat een transit amplifying cel mag doorlopen, het tijdstip waarop een cel de basale laag verlaat, de tijd die nodig is om het complete differentiatieproces te doorlopen, de differentiatielijn die gevolgd moet worden en wellicht nog veel meer momenten. Hierbij is elk afzonderlijk controlepunt belangrijk, maar alle regulatiestappen samen zorgen ervoor dat onze buitenkant bedekt blijft met een epitheel dat de binnenkant binnen houdt en de buitenwereld buiten. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van een aantal signaleringsroutes in de volwassen interfolliculaire epidermis. Zoals beschreven vindt er communicatie plaats tussen cellen van de epidermis (autocrien), maar ook tussen cellen van de epidermis en de onderliggende dermis (paracrien). Behalve de regulatie van epidermale differentiatie en proliferatie, lijken deze signaleringsroutes ook de proliferatieve cel-populaties van de germinatieve epidermis te controleren. Een hoog expressieniveau van bijvoorbeeld Delta-1 [9], β1-integrine [10], β-catenine en de Wnt signaleringsroute [11] lijkt keratinocyten in het stamcelcompartiment te houden, terwijl bijvoorbeeld c-Myc[12] en Notch1[9] de overgang van stamcellen naar het transit amplifying celcompartiment lijken te stimuleren. Deze processen worden op hun beurt weer gereguleerd door een grote hoeveelheid groeifactoren, zoals het proliferatiestimulerende EGF of het proliferatieremmende TGF-β. Zoals beschreven in hoofdstuk 1 heeft het (β1-integrine meerdere functies; het verbindt de basale cel met de extracellulaire matrix, maar het is ook een marker voor celkarakter en een belangrijk signaleringsmolecuul dat het lot van de cel bepaalt. Overexpressie van dit integrine in de suprabasale lagen van de muizenepidermis induceert een psoriatisch fenotype met een uitgesproken toegenomen proliferatie, een verdikking van de epidermis en een verstoorde, versnelde differentiatie [13-14]. Aangezien in de humane psoriatische epidermis in vivo de integrine expressie niet langer tot de basale laag beperkt blijft, maar ook in de suprabasale laag voorkomt en dit ook geldt voor het aantal delende cellen, lijkt het aannemelijk dat deze β1-integrine-positieve, delende cellen gerekruteerde transit amplifying cellen zijn en dit maakt deze subpopulatie tot een aantrekkelijke kandidaat voor onderzoek naar de pathogenese van psoriasis en hun respons op anti-psoriatische behandeling.
In hoofdstuk 2 en 3 van dit proefschrift hebben we aspecten van epidermale differentiatie en proliferatie bestudeerd tijdens antipsoriatische behandelingen. In hoofdstuk 2 hebben we het effect van een nieuw, systemisch retinoid op keratinocytengroei in de psoriatische laesie bestudeerd. Patiënten met matig ernstige tot ernstige plaque psoriasis werden behandeld met verschillende doseringen bexarotene (of Targretin®). Bexarotene is een recent ontwikkeld synthetisch RXR-selectief retinoid en is het momenteel goedgekeurd voor de behandeling van het cutane T cellymfoom[15]. Retinoiden zijn bekende modulatoren van epidermale groei en differentiatie, en ze induceren normale differentiatie en onderdrukken proliferatie in psoriatische keratinocyten. Aangezien bexarotene de overgang van proliferatie naar differentiatie leek te stimuleren in normale keratinocyten, werd het interessant om het effect van bexarotene op psoriatische keratinocyten te bestuderen. Na 12 weken therapie liet de PASI-score slechts een bescheiden verbetering van 28% zien. Met betrekking tot de keratinocytsubpopulaties zagen we een grote toename in de K10+K6- cellen en een duidelijke afname in de K10-K6+ cellen, terwijl geen significante veranderingen gezien werden in de populatie K10+K6+ cellen, de K10-K6- cellen, noch de basale proliferatieve activiteit of de hoeveelheid epidermale inflammatoire cellen tijdens flowcytometrische kwantificering. Het lijkt erop dat de bexarotene geïnduceerde RXR-activatie de hyperproliferatie-geassocieerde K6+ celpopulatie converteert naar een K10+ populatie met een normaal gedifferentieerd fenotype. Dit berust waarschijnlijk op een twee-stapsproces waarbij de K6+K10- cellen eerst een K6+K10+ (co-expressie) fenotype ontwikkelen, waarna deze K6+K10+ cellen differentiëren tot K6-K10+ cellen. Dit verklaart ook het feit dat er geen veranderingen werden gevonden in de K6+K10+ subpopulatie. Opvallend was echter dat er met de gebruikte doseringen bexarotene geen effect op de keratinocytproliferatie werd gezien. Deze bevinding berust mogelijk op een onderschatting van de werkelijke proliferatieve activiteit, aangezien het percentage cellen in de S-, G2- of M-fase van de celcyclus in de K10-K6- (zijnde basale) cellen werd gemeten, terwijl het met onze huidige kennis waarschijnlijk beter was geweest om de proliferatieve activiteit van andere subpopulaties te bepalen zoals bijvoorbeeld de K6+Kl0- cellen waarvan het aannemelijker is dat zij de transit amplifying cellen bevatten. Een andere mogelijkheid, welke zowel het vrijwel afwezige effect op de proliferatie als de bescheiden afname van de PASI-score verklaart, ligt in de doseringen die in deze studie toegepast werden en welke varieerden van 0,5-3 mg/kg lichaamsgewicht. In studies waarbij bexarotene gebruikt werd in de behandeling van maligniteiten werd namelijk een dosering voorgeschreven die 3 tot 5 keer hoger was als de dosering in onze studie [16,17]. Echter, bij de huidige dosering van bexarotene traden er al bijwerkingen op waaronder hyperlipidemie en hypothyroïdisme, waardoor een verhoging van de dosering bexarotene voor psoriatische patiënten niet reëel lijkt. Het zou eventueel wel mogelijk zijn om dit RXR-selectief retinoid te combineren met andere leden van de superfamilie van ligandgeactiveerde transcriptiefactoren zoals bijvoorbeeld een ligand voor de vitamine D3 receptort [18], of zelfs PPAR-liganden [19] die momenteel klinisch getest worden. Een combinatie van dergelijke middelen zou een betere anti-psoriatische respons kunnen induceren. Zoals duidelijk geworden zal zijn laat deze studie een direct effect van bexarotenegeïnduceerde RXR-activatie op de overgang van proliferatiegeassocieerde keratinisatie naar normale keratinisatie in de psoriatische epidermis zien, maar onze aandacht werd vooral getrokken door de mogelijkheid dat keratinocytsubpopulaties verschillend reageren op antipsoriatische therapie en dan vooral met het oog op de germinatieve subpopulaties.
In hoofdstuk 3 van dit proefschrift werd het effect van twee vitamine D3 analogen (calcipotriol of Daivonex® en calcitriol of Silkis® op de samenstelling en de DNA-synthese van epidermale celpopulaties verantwoordelijk voor het psoriatisch fenotype onderzocht. Gedurende 8 weken werden patiënten met een milde plaque psoriasis twee maal daags behandeld met calcipotriol en calcitriol zalf in een links/rechts vergelijkende studie. Behandeling met beide bestanddelen resulteerde in een aanzienlijke klinische verbetering, welke geïllustreerd werd door een afname van de PASI-score met meer dan 50%. Flowcytometrische kwantificering van de keratinocytsubpopulaties liet een reductie zien van de Kl0-K6- cellen en een toename van de K10+K6- subpopulatie. Veder werd er een correlatie gevonden tussen klinische verbetering tijdens de behandeling met calcipotriol en de K10+K6- subpopulatie en tussen de klinische respons op een behandeling met calcitriol en zowel de Kl0+K6- populatie, als ook het percentage cellen in de S-, G2- en M-fase van de celcyclus in de K10-K6- populatie. Deze bevindingen suggereren dat de K10+K6-subpopulatie meer relevant is voor het antipsoriatisclie effect van calcipotriol, terwijl zowel de K10+ (suprabasale compartiment bestaande uit gecommitteerde gedifferentieerde cellen) als de K10- populaties (basale compartiment bestaande uit stamcellen en transit amplifying cellen) relevant zijn voor het effect van calcitriol. We concludeerden dat verder onderzoek nodig is naar de keratinocytsubpopulaties (stamcellen, transit amplifying cellen en gecommitteerde keratiniserende cellen) om het in vivo werkingsmechanisme van therapeutica die ingrijpen op epidermale proliferatie en differentiatie beter te kunnen definiëren. Dergelijk onderzoek zou ook een bijdrage kunnen leveren aan ons begrip van de exacte rol van elke keratinocytsubpopulatie in de epidermale celbiologie van normale en hyperproliferatieve huid.
In hoofdstuk 4 hebben we dan ook de veranderingen van verschillende keratinocytsubpopulaties met betrekking tot keratine-expressie en proliferatieve activiteit bestudeerd tijdens een behandeling van een hyperproliferatieve aandoening (psoriasis) en dit vergeleken met de veranderingen die geïnduceerd werden door het tape-strip model; een gestandaardiseerde aanpak om hyper-proliferatie te induceren in de normale huid. Er werd een correlatie gevonden tussen de klinische respons tijdens een behandeling van milde psoriasis en de K 10+K6- subpopulatie en voorhet klinische effect in matig ernstige psoriasis en de Kl0-K6+ cellen. Zo resulteerde behandeling van milde psoriasis in een toename van de K10+K6- cellen en een afname van de K10-K6-cellen, terwijl een behandeling van matig ernstige psoriasis ook een effect had op de K10+K6- cellen, maar een afname van de K6+K10- cellen veroorzaakte. Tijdens beide behandelingen kon geen significante verandering in de proliferatieve activiteit van de K10-K6-cellen worden gevonden. Het tape-strip model liet echter veranderingen in de suprabasale keratine-expressie zien voorafgaand aan veranderingen in de proliferatieve activiteit. Evidente veranderingen in de subpopulaties K10+K6- en Kl0+K6+ cellen werden zelfs al 24 uur na het tape-strippen gezien, terwijl het percentage cellen in de S-, G2- en M-fase van de celcyclus niet veranderde tot 48 uur na het tape-strippen. Dit laatste werd voorafgegaan door veranderingen in de subpopulaties KIO-K6+ en K10-K6- cellen (zie hoofdstuk 4, Figuur 4, pagina 77). Deze bevindingen impliceren dat modulatie van differentiatie plaatsvindt voordat de proliferatieve activiteit wordt aangepast en dat subsets van keratinocyten wellicht verschillend reageren op de tape-strip trigger. Het lijkt erop dat “late” transit amplifying cellen kunnen reageren met een normalisatie van hun keratine-expressieprofiel, wat de veranderingen in de K10+K6- cellen, de KtO+K6+ cellen en ook de K10-K6+ cellen verklaart. Aan de andere kant lijken “jonge” transit amplifying cellen, welke ontstaan zijn uit een stamceldeling of misschien zelfs gerekruteerd worden uit Go, eerst het compartiment K 10-K6- cellen aan te vullen en nemen dan vervolgens een Kl0-K6+ fenotype aan dat geassocieerd is met hyperproliferatie. Kortom, het lijkt erop dat subpopulaties van keratinocyten verschillend reageren op een trigger veroorzaakt door ofwel het tape-strippen of een anti-psoriatische behandeling. Gedurende beide anti-psoriatische behandelingen hebben wij echter geen verandering in de proliferatieve activiteit van het basale compartiment (K10-K6-cellen) kunnen waarnemen; dit zou kunnen betekenen dat er grotere aantallen cellen geanalyseerd moeten worden alvorens veranderingen waarneembaar zijn, maar dit kan ook betekenen dat de voornaamste proliferatieve activiteit in een andere subpopulatie cellen optreedt, zoals bijvoorbeeld de cellen die K6 tot expressie brengen. In het tape-strip model, daarentegen, zagen we een evidente respons van de prolifererende cellen in het Kl0-K6-compartiment binnen 48 uur na tape-strippen. Het is niet aannemelijk dat dit allemaal stamcellen zouden zijn, aangezien men veronderstelt dat een stamcel slechts weinig frequent deelt en een lange celcyclustijd heeft [20-21]. Het is waarschijnlijker dat deze cellen “jonge” transit amplifying cellen zijn, die het stamcelcompartiment net verlaten hebben en in G0 wachten op verdere instructies. Alleen deze cellen zouden namelijk in staat zijn tot een dergelijke snelle respons. Blijkbaar is een dergelijke populatie echter niet voor handen in de psoriatische epidermis in vivo, aangezien de voornaamste proliferatieve activiteit in dit geval in een andere subpopulatie (K6+?) lijkt plaats te vinden. Is het wellicht mogelijk dat transit amplifying cellen in de psoriatische epidermis in vivo niet langer wachten in G0 maar direct deelnemen aan de celcyclus en met een hoge snelheid starten met amplificeren? Dit zou namelijk tevens verklaren waarom subsets van meer gedifferentieerde keratinocyten eerder reageren op anti-psoriatische therapieën dan ongedifferentieerde prolifererende cellen.
Deze laatste vraag zorgde ervoor dat we toenemend geboeid raakten door de subpopulaties van prolifererende keratinocyten en we de focus van ons onderzoek gingen richten op het germinatieve compartiment van de epidermis met een speciale aandacht voor de cellen met een snelle en hoog proliferatieve capaciteit; de transit amplifying cellen. In hoofdstuk 5 van dit proefschrift hebben we dan ook de fenotypische en functionele verschillen van de germinatieve subpopulaties bestudeerd. Geïsoleerde keratinocyten werden hiervoor gesorteerd op basis van hun X31-integrineexpressie, aangezien men aanneemt dat een hoge (3i-integrine-expressie (“bright”) correspondeert met de veronderstelde epidermale stamcellen, terwijl transit amplifying cellen een lage (β1-integrine-expressie (“dim”) vertonen[22]. Voor onze eerste analyse werd gebruik gemaakt van normale huid van patiënten die plastische chirurgie ondergingen; op deze manier konden er voldoende cellen geïsoleerd worden voor een clonale analyse. Wanneer we vervolgens de groeisnelheden van de (β1-integrine bright en de (β-integrine dim subpopulaties met elkaar vergeleken, bleken de kolonies in de (β1-integrine dim subpopulatie sneller te groeien dan de kolonies in de bright subpopulatie. Verder bleek ook het aantal kolonies in de (β1-integrine dim subpopulatie het aantal in de bright subpopulatie te overstijgen. Deze bevindingen kunnenwaarschijnlijk verklaard worden door het verschil in celcyclustijd tussen stamcellen en transit amplifying cellen. Het zal duidelijk zijn dat het langer duurt voordat een transit amplifying cel uit een stamcel voortkomt, dan wanneer een transit amplifying cel uit een andere transit amplifying cel voortkomt. In het laatste geval, zal elke transit amplifying cel namelijk na het inzaaien in een kweekplaat meteen beginnen met kolonievorming en dit gebeurt zonder verdere vertraging door een lange celcyclustijd zoals dit bij een stamcel het geval is. Dit verklaart zowel het verschil in kolonie-aantal als het verschil in hun groeisnelheid. Met deze bevindingen in gedachten, zou men ook een verschil verwachten in de start van kolonie-vorming tussen de (β1-integrine bright en dim subpopulatie. Het zou nu namelijk voor de hand liggen dat de kolonievorming in de β1-integrine dim subpopulatie eerder optreedt dan in de bright subpopulatie. Merkwaardig genoeg konden we echter geen verschil in de start van kolonievorming tussen beide subpopulaties aantonen. Echter, dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de experimentele setting; we waren namelijk niet in staat om de vroege kolonievorming te detecteren: met een helder veld microscoop kunnen kolonies namelijk pas gedetecteerd worden als ze uit tenminste 20 cellen bestaan. Een opmerkelijke bevinding was daarentegen dat de celgrootte in de kolonies van de (β1-integrine bright subpopulatie toenam in de tijd, terwijl er geen verdere toename in grootte geconstateerd kon worden in de dim subpopulatie. Dit is in tegenstelling tot andere onderzoekers die suggereerden dat er een initieel verschil in celgrootte bestaat en dat de kolonievormende capaciteit van de betreffende cel hieruit afgeleid kan worden; met andere woorden: kleine keratinocyten genereren kolonies met een hoge frequentie, terwijl grotere keratinocyten dit met een veel lagere frequentie doen. De onderzoekers suggereerden echter wel dat dit verschijnsel in kweek verloren ging[23] Jones en Watt lieten echter in hun onderzoek zien dat cellen die gesorteerd worden op basis van hun hoge of lage (β1-integrine-expressie minder dan 1 µm in diameter verschillen en dat celgrootte niet correleert met kolonievormende efficiëntie (wat betekent: het percentage ingezaaide cellen dat ook daadwerkelijk een kolonie vormt)[22]. In onze experimenten werd gebruik gemaakt van keratinocyten die direct geïsoleerd waren uit humane huid, terwijl andere onderzoekers eerst het aantal keratinocyten afkomstig van een huidbiopt vermenigvuldigden door deze cellen in kweek te brengen en voerden vervolgens hun experimenten pas uit met cellen uit deze voorraad. In het laatste geval zal een verschil in celgrootte in de eerste kweken zijn opgetreden en dus onopgemerkt zijn gebleven. Het is bekend dat wanneer cellen de basale laag verlaten, ze niet alleen differentiëren maar ook toenemen in grootte. Het is dus aannemelijk dat transit amplifying cellen in grootte zullen toenemen wanneer zij de basale laag verlaten en dit verklaart de toegenomen celgrootte in de β1-integrine bright subpopulatie. Deze bestaat namelijk uit “jonge” transit amplifying cellen die kort daarvoor uit stamcellen ontstaan zijn, terwijl de Ri-integrine dim subpopulatie voornamelijk “oude” transit amplifying cellen bevat die niet meer veel in omvang zullen toenemen. Met betrekking tot de groeipotentiaal is het echter belangrijk om in acht te nemen dat de kweek-periode in ons experiment slechts 30 dagen besloeg. Men gaat er over het algemeen van uit dat een stamcel een ongelimiteerde proliferatieve potentiaal heeft, terwijl een transit amplifying cel alleen een korte periode van weliswaar hoge proliferatieve activiteit kent. In onze kweekstudie hebben we dus de hoge en snelle proliferatieve potentiaal van gekweekte transit amplifying cellen gedemonstreerd, terwijl de stamcelfractie aanzienlijk meer tijd nodig had om op gang te komen. Zou tijd echter geen beperkende factor zijn, dan is het heel waarschijnlijk dat de kolonies in de (β1-integrine bright subpopulatie niet alleen het aantal kolonies in de dim subpopulatie zouden overstijgen maar uiteindelijk ook hun groeisnelheid. Om homeostase te kunnen behouden in normale huid; moet er een goed gereguleerde balans bestaan tussen stamcelvernieuwing en het ontstaan van transit amplifying cellen die een gelimiteerd aantal snelle en amplificerende celdelingen ondergaan alvorens ze verworden tot postmitotische, terminaal gedifferentieerde keratinocyten. In de hyperproliferatieve psoriatische epidermis daarentegen zou deze balans wel eens verstoord kunnen zijn, wat de uitgesproken toename in celaantal zou verklaren, maar ook het verstoorde en versnelde differentiatieproces, ook wel bekend als “regeneratieve maturatie of differentiatie”. Om deze reden werden in hoofdstuk 6 de [β1-integrine bright en dim subpopulaties van normale en psoriatische huid onderzocht op fenotypische en functionele verschillen daarbij gebruikmaken van een vergelijkbaar kweeksysteem, immunocytochemie, multipara-meter flowcytometrie en real time kwantitatieve PCR. In deze studie werden 6-well kweekplaten gebruikt in plaats van 96-well platen, wat niet alleen het bestuderen van koloniemorfologie mogelijk maakte, maar ook immunocytochemie van individuele kolonies die hiertoe op toverslips gekweekt werden. Sommige bevindingen voldeden aan onze verwachting, zoals bijvoorbeeld verschillen in de expressie van K6, K10 en het Ki-67 antigen, maar een zeer opvallende bevinding was het belangrijke verschil in fenotype van de psoriatische transit amplifying cel vergeleken met het fenotype van zijn normale soortgenoot.
Het wordt over het algemeen aangenomen dat cellen zodra ze het basale compartiment verlaten zich committeren tot terminale differentiatie. Transit amplifying cellen wordt nog een aantal proliferatierondes toegestaan waarin ze het aantal gedifferentieerde keratinocyten amplificeren, maar daarna raken ook zij gedifferentieerd en zijn ze niet langer meer in staat om te prolifereren. Een algemene veronderstelling is het feit dat proliferatie alleen optreedt in cellen gelegen in de basale laag, maar tijdens studies naar normale huid na tape-strippen en psoriatische huid tijdens een klinische relaps werden grote aantallen delende cellen in de eerste suprabasale lagen gezien [24-26]. Dit suggereert dat proliferatieve activiteit niet alleen voorbehouden is aan de basale laag, maar dat ook transit amplifying cellen die de basale laag verlaten hebben nog steeds tot proliferatie aangezet kunnen worden. Dit impliceert dat transit amplifying cellen enerzijds een proliferatief fenotype kunnen aannemen meteen nadat ze uit een stamceldeling ontstaan zijn, of zich anderzijds kunnen onthouden van proliferatie en in de Go fase van de celcyclus blijven totdat zij een bepaalde trigger ontvangen.
Dit verklaart de snelle respons van prolifererende keratinocyten zoals gezien wordt bij wondgenezing in vivo en ook het hoge aantal snel groeiende kolonies in de (β1-integrine dim keratinocyten in vitro. Inderdaad vonden we karakteristieken van zowel een prolifererend fenotype als ook een differentiërend fenotype in de β11-integrine dim subpopulatie van normale huid. In de psoriatische β1-integrine dim fractie zagen we echter een dergelijke combinatie alleen in de vers geïsoleerde cellen, terwijl deze cellen zodra ze in kweek gebracht werden opmerkelijke verschillen vertoonden. Terwijl de transit amplifying cellen uit normale huid in staat waren om te prolifereren in kweek, bleken de psoriatische dim (veronderstelde transit amplifying cellen) keratinocyten niet langer in staat een proliferatief fenotype aan te nemen, maar raakten zij vrijwel meteen na het inzaaien gedifferentieerd. Vers geïsoleerde psoriatische dim cellen lieten bovendien een sterke expressie zien van markers geassocieerd met regeneratieve differentiatie in de psoriatische epidermis, zoals PA-FABP, psoriasin en elafin, waaruit hun commitment tot differentiatie blijkt. Eenmaal in vitro werd echter een zeer opvallende downregulatie van al deze markers gezien. Dit ogenschijnlijke verlies van het psoriatische fenotype in kweek suggereert dat de geïsoleerde psoriatische transit amplifying cellen niet langer in staat zijn om het regeneratieve maturatie fenotype zoals dit in psoriasis gezien wordt, te induceren ondanks hun duidelijke commitment tot terminale differentiatie. Mogelijk is dit een gevolg van de isolatie van transit amplifying cellen uit hun natuurlijke omgeving, wat suggereert dat transit amplifying cellen in de psoriatische epidermis in vivo reageren op een zekere trigger, welke hen aanzet tot proliferatie en het aannemen van een psoriatisch fenotype. Daarbij suggereren onze data een sterk commitment tot regeneratieve (psoriatische) differentiatie in vers geïsoleerde psoriatische (β1-integrine dim) transit amplifying cellen en tegelijkertijd een afgenomen proliferatieve capaciteit in kweek, wat suggereert dat de psoriatische transit amplifying cellen verder gevorderd zijn in hun levenscyclus dan de transit amplifying cellen in normale huid.
Wanneer we deze data samen nemen, komen we dan ook tot een nieuw model voor epidermale groei in de normale en psoriatische epidermis, waarin we een restrictiepunt op het niveau van de transit amplifying cel voorstellen (zie Figuur 1 op pagina 111 en 142). In het algemeen werd aangenomen dat stamcellen zich “rustend” in de Go- of G1-fase van de celcyclus bevinden, maar een recent onderzoek in de muizen-epidermis toonde aan dat stamcellen wel degelijk de celcyclus doorlopen, maar dat slechts een laag percentage zich ook werkelijk in de S-, G2- of M-fase van de celcyclus bevindt (naar schatting 4%). Dezelfde studie liet tevens zien dat de veronderstelde transit amplifying cellen een hoger percentage delende cellen bevatten van ongeveer 15% [8]. In de normale epidermis lijkt het er dus op dat rustende transit amplifying cellen na bijvoorbeeld verwonding van deepidermis gerekruteerd kunnen worden om aan de celcyclus deel te nemen. Wat de psoriatische epidermis betreft, veronderstellen wij nu dat psoriatische transit amplifying cellen niet of minder beperkt worden tot Go, maar beginnen te prolifereren zodra ze uit een stamcel ontstaan zijn. Dit zou namelijk hun sterk geïnduceerde proliferatieve activiteit in vivo verklaren, wanneer we vers geïsoleerde β1-integrine dim cellen van normale huid vergelijken met dezelfde populatie uit de psoriatische huid. Terwijl rustende normale transit amplifying cellen worden getriggerd om te prolifereren zodra ze in een kweekplaat gezaaid worden, stagneren de psoriatische transit amplifying cellen vrijwel meteen aangezien zij hun amplificerende taak reeds in vivo uitgevoerd hebben. Wanneer we het commitment tot differentiatie vergelijken, zien we een sterkere expressie van differentiatiemarkers in de psoriatische β1-integrine dim cellen dan in hun normale verwanten, suggererend dat psoriatische transit amplifying cellen niet alleen meer celdelingen hebben doorlopen, maar ook nog sterker gecommitteerd zijn tot terminale differentiatie. Dit duidt op een belangrijke rol voor de transit amplifying cel in epidermale groei en het zou dan ook de moeite waard zijn om te onderzoeken of het gedrag van deze cellen in vivo genormaliseerd kan worden door antipsoriatische therapie. Echter, er is vrijwel geen literatuur over het effect van anti-psoriatische therapieën op de verschillende germinatieve subpopulaties in de psoriatische epidermis. In een studie naar het effect van vitamine D3 suggereert Gniadecki dat deze behandeling verschillende effecten had op actief groeiende, ongedifferentieerde stamcellen (blokkeren van proliferatie) en op meer gedifferentieerde transit amplifying cellen (stimulatie van mitose), wat een verklaring zou kunnen zijn voor de geremde celgroei in kweek of psoriasis enerzijds en stimulatie van groei in normale huid anderzijds [27]. Wanneer we echter anti-psoriatische therapieën selectief zouden willen richten op een specifieke germinatieve celpopulatie; op welke subpopulatie moeten we ons dan richten? De stamcel? Of de transit amplifying cel? Maar dan: een “jonge” transit amplifying cel, of een “oudere” en dus meer gedifferentieerde transit amplifying cel? In het eerste geval zal het effect van het anti-psoriatische middel waarschijnlijk lang aanhouden, ervan uitgaande dat de “psoriatische fout” in de stamcel gecorrigeerd wordt. Aangezien een stamcel echter weinig frequent deelt en een lange celcyclustijd heeft, zal men wel geduld moeten hebben, want een klinische respons laat vrijwel zekere even op zich wachten. Richt men zich daarentegen op de transit amplifying cel, dan kan men een snelle respons verwachten, aangezien deze cellen al actief delen. Verder zijn er nu twee opties mogelijk: ofwel de “jonge” transit amplifying cel wordt actief van het amplificeren weerhouden en wordt tot rust gemaand in Go, ofwel de reeds “oudere” transit amplifying cel wordt gestimuleerd om zijn proliferatie-programma te beëindigen en te beginnen met differentiëren op een meer gecontroleerde (“normale”) manier. Desondanks, is het in al deze gevallen waarschijnlijk dat het antipsoriatische middel toch nog herhaaldelijk aangebracht moeten worden, daar de meeste rustende cellen niet zullen reageren op het middel. Toch vormen de germinatieve subpopulaties meer dan interessante targets voor anti-psoriatische therapie en nopen zij tot verder onderzoek.
2. Van transit amplifying cel naar kliniek
Het zal duidelijk zijn dat alvorens we selectief subpopulaties van germinatieve cellen tijdens ziekte kunnen aanpakken, er eerst een methode zal moeten zijn waarmee een zuivere isolatie van de gewenste celpopulatie mogelijk is en het is wellicht overbodig om te vermelden dat we momenteel nog niet zover zijn. In het verleden werden -en ook op dit moment worden nog steeds- serieuze pogingen ondernomen om markers te vinden die een meer specifieke identificatie en isolatie van stamcellen of transit amplifying cellen mogelijk maken [20;28;29]. Een frequent toegepaste methode om fracties te isoleren die verrijkt zijn voor de veronderstelde stamcel of de zogenaamde transit amplifying cel, berust op het sorteren van deze cellen op grond van hun hoge of lage β1-integrine-expressie [22]. Deze fracties zijn weliswaar verrijkt voor het beoogde celtype, maar zijn desondanks nog steeds verontreinigd met andere cellen. Andere onderzoekers hebben dan ook een alternatieve methode aangedragen die een specifiekere isolatie van beide fracties mogelijk zou maken door de expressiepatronen van het u6-integrine en CD71 te combineren [30-32]. In hoofdstuk 6 van dit proefschrift hebben we echter laten zien dat deze markers maar weinig verschillen tussen de fracties verrijkt voor stamcellen of voor transit amplifying cellen. Een opvallende bevinding was echter dat de vers geïsoleerde (β1-integrine positieve fracties van normale en psoriatische keratinocyten een vergelijkbaar mRNA- niveau vertoonden voor collageen VII als voor de zogenaamde stamcelmarker p63. Flowcytometrische analyse van (β1-integrine positieve keratinocyten liet een kleine populatie cellen zien die (β1-integrine bright en collageen Vll bright waren en bovendien een lage side scatter (flowcytometrische parameter; een maat voor de vorm en granulariteit van een cel) hadden (zie Figuur 2 op pagina 112 en 143). Aangezien deze cellen maar 1-2% van het totaal aantal gemeten cellen voor hun rekening namen, en zowel het β1-integrine als collageen VII door basale cellen tot expressie worden gebracht, vormen deze cellen een interessante populatie en is verder onderzoek naar dit mogelijke nieuwe stamcelfenotype geïndiceerd. Op dit moment is de exacte herkomst van deze cellen echter nog onduidelijk. Collageen VII wordt namelijk gesynthetiseerd en uitgescheiden in de extracellulaire matrix in de vorm van een precursor, namelijk het procollageen VII. Tijdens de fibrilpolymerisatie, wordt een C-terminaalgebonden propeptide proteolytisch verwijderd, waarna de collageen VII monomeren dimeren vormen en deze dimeren vervolgens aggregeren tot de zogenaamde ankervezels. Deze ankervezels stralen uit van de lamina densa naar de papillaire dermis waar ze aanhechten in de zogenaamde “anchoring plaques”, of ze vormen een lus terug naar de lamina densa, waardoor ze een belangrijke bijdrage leveren aan de dermaleepidermale integriteit [33;41]. Binnen het “anchoring complex” (bestaande uit het α6β4-integrine, ankervezels en ankerfilamenten) verbindt het laminine 5 vermoedelijk het α6β4-integrine met collageen VII. Er is dus geen direct contact tussen een integrine op een basale cel en het mature collageen VII. Hoe kunnen we dan de kleine (β1-integrine bright en collageen VII bright cellen in ons experiment verklaren? Misschien herkent ons antilichaam een deel van het procollageen VII wanneer dit door de basale keratinocyten uitgescheiden wordt, of het vertoont kruisreactiviteit met het collageen XVII in de ankerfilamenten die de epidermis aan de andere kant van de basaalmembraan bevestigen. Het is hoe dan ook opmerkelijk dat basale keratinocyten collageen VII produceren, aangezien in het algemeen de synthese, productie en depositie van extracellulaire matrixeiwitten voor de rekening van dermale fibroblasten komt. Daarbij zou de basaal-membraan een sufficiënte barrière moeten vormen voor macromoleculen, maar blijkbaar mag (pro-) collageen VII de dermale-epidermale overgang passeren [35]. Een andere mogelijkheid is dat sommige basale cellen daadwerkelijk collageen VII produceren en uitscheiden in een poging een “niche”-achtige omgeving te creëren, zoals dat ook bij de stamcellen in de haarfollikel gezien wordt. Wanneer we het fenotype van deze celpopulatie willen achterhalen, dan zullen we deze cellen moeten sorteren op grond van hun hoge (β1-integrine- en collageen V11-expressie. Blijkt het inderdaad een populatie keratinocyten te betreffen, dan is klonale analyse de volgende stap waarbij we de fenotypische en functionele kenmerken van deze cellen kunnen bestuderen. Tot het moment waarop een definitieve marker voor stamcellen ontdekt wordt, zal men de geïsoleerde fracties van stamcellen alleen kunnen zuiveren door een aantal potentiële markers voor dit fenotype te combineren. In het geval van transit amplifying cellen zal dit gecompliceerder zijn, aangezien deze cellen in de loop van de tijd differentiëren en we hier dus met een “maturerend” fenotype te maken hebben. Eventuele markers zullen dan ook specifiek moeten zijn voor een bepaald moment in dit maturatieproces; reikend van een “jonge” transit amplifying cel die net ontstaan is uit een stamceldeling tot een “oude” transit amplifying cel die net zijn laatste deling doorlopen heeft en zich compleet zal toeleggen op terminale differentiatie. Sommige auteurs betwijfelen zelfs of de epidermale stamcel wel echt een bepaald fenotype heeft, of dat dit simpelweg een keratinocyt “op de juiste plaats en op de juiste tijd” betreft, wat betekent dat een basale keratinocyt een stamcel wordt onder invloed van omgevingsfactoren zoals bijvoorbeeld een nicher [20]. Dit zou zelfs kunnen betekenen dat een transit amplifying cel nog kan terugkeren naar het stamcelfenotype.
Als deze omgevingsfactoren inderdaad belangrijk zijn voor het stamcelfenotype, dan zouden cellen die in een dergelijke “niche” verblijven mRNA tot expressie moeten brengen wat hen in staat stelt om een interactie aan te gaan en te kunnen reageren op deze omgeving. Waarschijnlijk zullen deze cellen zelfs mRNA tot expressie brengen van eiwitten of receptoren die hen in staat stellen om in deze niche verankerd te blijven totdat ze de opdracht krijgen deze plek te verlaten. Recent slaagden een groep onderzoekers er dan ook in om label-retaining cellen (LRC) uit de stamcelregio van de haarfollikel (ook wel “bulge” genoemd) te isoleren en het transcriptieprofiel van deze cellen te bepalen, wat vergeleken met andere stamcellen de opmaak van hun niche zal definiëren [36]. De auteurs toonden aan dat cellen in de niche slechts zelden delen, maar dat hun eigenschappen meteen veranderen zodra ze worden gestimuleerd om deze niche te verlaten. Behalve bekende “bulge”-factoren (welke niet besproken worden in dit proefschrift) zoals bijvoorbeeld CD34, Tcf3, β1-integrine, β4-integrine en a6-integrine, bleken ook regulatoren van de celcyclus en inhibitoren van keratinocytengroei (TGF-β) en leden van de Wntsignaleringsroute opgereguleerd in deze bulge LRC. Verder werd ook opregulatie van de mRNA niveaus van diverse extracellulaire matrixeiwitten geconstateerd, zoals onder andere tenascine C, collageen 6a1 en collageen 18a1, wat suggereert dat deze componenten deel uitmaken van de directe omgeving van de bulgecellen of zelfs hun niche. In deze LRC bleek het opgereguleerde mRNA voornamelijk te coderen voor secretoire of integrale membraaneiwitten, wat doet vermoeden dat de LRC van de huid in staat zijn om hun eigen niche te organiseren, te communiceren met hun buren en kunnen reageren op hun speciale omgeving [36]. Het zal duidelijk zijn dat dit bijdraagt aan het belang van de hoge collageen VII mRNA-niveaus die wij constateerden in onze (31-integrine bright subpopulaties van normale en psoriatische huid, zoals boven beschreven. Aangezien stamcellen alleen in de basale laag voorkomen, zowel in de interfolliculaire epidermis als de haarfollikel, vormen moleculen betrokken bij cel-substratum adhesie per definitie interessante stamcel-markers. Helaas is het niet bekend of de stamcel van de interfolliculaire epidermis ook over een dergelijke beschermende en informatieve niche beschikt als de bulge-stamcel. Het is op dit moment zelfs nog onduidelijk hoe de stamcel uit de haarfollikel en de stamcel van de interfolliculaire epidermis zich verhouden; is de bulge-stamcel de “echte” stamcel en komt de interfolliculaire stamcel hier uit voort, of zijn dit twee verschillende stamceltypen met elk hun eigen differentiatielijn. Het feit dat de onbehaarde huid van handpalmen en voetzolen ook constant wordt vernieuwd en kan herstellen van verwonding impliceert dat stamcellen niet exclusief haarfollikelgebonden kunnen zijn.
Wellicht zijn beide celtypen in wezen hetzelfde, maar is het de omgeving die deze cellen een bulge of interfolliculair fenotype oplegt. Het is algemeen bekend dat na verwonding of transplantatie de bulge-stamcellen erin slagen om haarfollikels te generen, maar ook talgklieren en interfolliculaire epidermis kunnen vormen. Naar aanleiding van deze bevindingen nam men aan dat de stamcel uit de bulge-regio een multipotente stamcel is en de interfolliculaire stamcel een unipotente stamcel, aangezien deze laatste alleen interfolliculaire epidermis kan genereren. Repopulatiestudies van Reynolds en Jahoda suggereerden echter dat beide celtypen multipotent zijn en dat de interactie met andere cellen hun lot bepaald [37]. Behalve instructieve informatie uit de omgeving lijkt ook de Wntsignaleringsroute een belangrijke rol te spelen in de beslissing van stamcellen om een bepaalde differentiatielijn te volgen. Wanneer β1-catenine namelijk tot overexpressie wordt gebracht in de muizenepidermis, blijkt de interfolliculaire epidermis te kunnen kiezen tussen een epidermaal of haarfollikel-lot[38].
Het zal ‘duidelijk zijn dat identificatie van moleculen betrokken bij de bepaling van het lot van een (stam-) cel een evidente bijdrage zal leveren aan ons begrip van deze germinatieve subpopulaties; het zal ons niet alleen in staat stellen om de verschillende germinatieve subpopulaties te onderscheiden, maar wellicht ook om specifieke germinatieve subpopulaties te beïnvloeden in het geval van ziekte. Het bestuderen van deze cellen in hun niche vormt een manier om het stamcelmysterie op te lossen, maar pogen deze cellen uit hun omgeving te isoleren en hun gedrag buiten de niche te bestuderen kan een andere manier zijn. Men zou de micro-omgeving van basale cellen in vitro zelfs kunnen manipuleren, door bijvoorbeeld dermale cellen of onderdelen van de extracellulaire matrix aan gekweekte keratinocyten toe te voegen. Wellicht zou dit ons in staat stellen om germinatieve subpopulaties in vitro te bestuderen, terwijl ze zich toch in een beschermende en instructieve omgeving bevinden lijkend op de in vivo situatie. Een dergelijke poging werd ondernomen door de groep van Kaur, die in eerder onderzoek suggereerden dat epidermale stamcellen en transit amplifying cellen succesvol geïsoleerd kunnen worden op basis van hun α6-integrine- en CD71- expressiepatroon. In hun meest recente werk tonen zij aan dat zowel epidermale stamcellen als transit amplifying cellen een volledig gestratificeerde epidermis kunnen genereren in vitro. Hierbij hebben zij gebruik gemaakt van een organotypisch kweeksysteem, bestaande uit een collageen 1 matrix waarin fibroblasten voorkomen (ook wel dermale equivalent genoemd), waarop vervolgens subpopulaties van a6-integrine bright/ CD71 dim (veronderstelde stamcellen), a6-integrine bright/ CD71 bright (veronderstelde transit amplifying cellen) en a6-integrine dim (gedifferentieerde cellen) neonatale voorhuidkeratinocyten werden gezaaid. Tegen alle verwachtingen in, slaagden alle drie de subpopulaties erin om een gestratificeerde epidermis te vormen mits er een juist micromilieu bestond, bestaande uit de aanwezigheid van dermale cellen en de extracellulaire matrixeiwitten laminine 10/11. Er werd wel geconcludeerd dat de stamcelfractie de meest “normale” epidermis zou produceren, aangezien deze fractie homeostase zou bereiken [39]. Alhoewel er over het algemeen werd aangenomen dat het vermogen om weefsel te regenereren was voorbehouden aan de stamcellen die in dit weefsel verblijven, blijken dus nu ook transit amplifying cellen in staat tot uitgebreide epithelialisatie. Sterker nog, 4 dagen na het inzaaien hadden de transit amplifying cellen al een meerlagige epitheliale sheet gevormd, terwijl de stamcelfractie en de fractie bestaande uit gedifferentieerde cellen slechts een dunne sheet epidermis hadden gevormd. De auteurs suggereren dan ook dat dit een gevolg is van de actief delende staat van transit amplifying cellen in vivo, en dat transit amplifying cellen wellicht de eerste subpopulatie keratinocyten zijn die zullen prolifereren als reactie op een trigger zoals bijvoorbeeld verwonding [39]. Dit komt overeen met onze bevindingen zoals beschreven in hoofdstuk 5 en 6 van dit proefschrift. Hoewel wij niet de regeneratieve capaciteit van de β1-integrine bright en dim cellen hebben bestudeerd, hebben we het gedrag van deze cellen in kweek bestudeerd en onderzocht of dit verschillend is voor normale en psoriatische keratinocyten. Wij vonden eveneens een sterk committent tot regeneratieve maturatie in de psoriatische dim cellen, en tevens een hoog proliferatief vermogen in vivo. Echter, beide karakteristieken gingen verloren zodra de psoriatische dim cellen geïsoleerd werden uit de epidermis en in kweek gebracht werden. Klaarblijkelijk reageren deze cellen op een trigger in de in vivo situatie, welke schijnbaar niet langer bestaat in de in vitro situatie. Of dit verschijnsel voorkomen kan worden door “omgevingsfactoren” aan de kweek toe te voegen, moet nog onderzocht worden, maar het is evident dat transit amplifying cellen een belangrijke rol spelen in epidermale groei, zowel in wondgenezing als in de hyper-proliferatieve huidziekte psoriasis. Om de regeneratieve capaciteit van onze (β1-integrine bright en dim cellen te bepalen, hebben we deze subpopulaties afkomstig uit normale huid ingezaaid op een “de-epidermized dermis” (DED; epidermisloze dermis), wat een ander voorbeeld van een dermale equivalent is. Alhoewel dit slechts een pilotstudie betrof, zagen we wel degelijk vorming van een epitheliale sheet in zowel de β1-integrine bright als dim fractie, wat overeenkomt met de bevindingen van Kaur en medewerkers zoals boven beschreven. Het leek er op dat de epitheliale sheet gevormd door de β1-integrine dim keratinocyten meer gedifferentieerd (K10-expressie, dikte van het aantal verhoornde cellagen) was en meer proliferatieve activiteit (Ki-67 positieve cellen) vertoonde dan de sheet gevormd door de (β1-integrine bright cellen (zie Figuur 3 op pagina 115 en 144). Dit was echter slechts een pilotstudie en wij zullen deze experimenten verder uitbreiden, mogelijk zelfs met bijvoorbeeld het toevoegen van groeifactoren zoals KGF. Van KGF is namelijk bekend dat het de driedimensionale organisatie van een gekweekte epidermis verbetert[40] waardoor het epitheliale weefsel dat gevormd wordt door de verschillende subpopulaties beter beoordeeld kan worden. Daarnaast zullen we vergelijkbare experimenten uitvoeren met de β1-integrine bright en dim cellen van de psoriatische epidermis om te bepalen of deze cellen in kweek nog over een regeneratief vermogen beschikken en in welke mate. Het zal zeer interessant zijn om vast te stellen of psoriatische transit amplifying cellen nog weefsel kunnen regenereren in kweek wanneer we gebruik maken van een dermale equivalent, eventueel met of zonder toegevoegde groeifactoren. Zoals we in hoofdstuk 6 demonstreerden, stagneren de psoriatische transit amplifying cellen zodra ze geïsoleerd in kweek worden gebracht, maar het moet nog blijken of deze cellen alsnog aangezet kunnen worden tot differentiatie en proliferatie wanneer zij worden blootgesteld aan het juiste micromilieu zoals dit gesuggereerd wordt in het werk van Kaur. Verder zou het interessant zijn om de proliferatieve toestand van het weefsel te bepalen dat gevormd wordt door psoriatische PI-integrine bright en dim keratinocyten; is het hyperproliferatief en vertoont het regeneratieve maturatie zoals dit gezien wordt in een psoriatische laesie? Alhoewel ook normale keratinocyten in kweek “geactiveerd” raken, zal nog moeten blijken of de gekweekte epidermis van psoriatische keratinocyten intrinsiek verschilt van de epidermis gekweekt uit normale keratinocyten. Onze bevindingen in hoofdstuk 6 suggereren dat de transit amplifying cellen in psoriatische huid in vivo niet of minder beperkt worden tot Go, waardoor ze vrijwel onbelemmerd de celcyclus kunnen ingaan meteen nadat ze uit een stamceldeling ontstaan zijn. Op deze manier zullen de psoriatische transit amplifying cellen al bezig zijn met amplificeren op het moment dat ze op een dermale equivalent gezaaid worden, terwijl de normale transit amplifying cellen dan nog moeten starten. Het is dan ook aannemelijk dat de beide subpopulaties een verschillende epidermale sheet zullen vormen. Wanneer dit inderdaad het geval blijkt, zal het de moeite waard zijn om te pogen het psoriatische fenotype te herstellen door factoren toe te voegen die betrokken zijn bij de controle van epidermale groei en keratinocytproliferatie, maar ook bijvoorbeeld bekende of nieuwe anti-psoriatica. Hebben we namelijk eenmaal vastgesteld welke germinatieve epidermale subpopulatie reageert op de (interne of externe) trigger die resulteert in het psoriatische fenotype, dan kunnen we proberen dit mechanisme te controleren of te blokkeren. Hopelijk leidt dit tot nieuwe therapieën voor deze chronische huidziekte en zal daarmee de kwaliteit van leven van een grote groep patiënten verbeteren.