2004_Proefschrift_Zeeuwen, P. Auteur: P. Zeeuwen
Promotiejaar: 2004
ISBN-10: 90-9018190-3

Samenvatting

Een belangrijk aandachtspunt in het onderzoeksprogramma van de afdeling Dermatologie is de regulatie van epidermale homeostase en de rol van proteases en hun remmers in barrièrefunctie en protectie van het individu. Teneinde een systematisch en kwantitatief overzicht te verkrijgen van genen die in epidermale cellen tot expressie komen, zijn we enkele jaren geleden gestart met het maken van transcriptomen van humane gekweekte keratinocyten en epidermis door middel van “Seriële Analyse van Gen Expressie” oftewel SAGE. Deze techniek is gebaseerd op het principe dat de kennis van slechts een klein deel van een sequentie van een gen dat afkomstig is van een gedefinieerde plaats in het gen, voldoende is om een mRNA voor dat gen te identificeren. Deze kleine stukjes sequentie (“tags”) kunnen met behulp van SAGE serieel worden geanalyseerd, en zo hebben we destijds niet alleen informatie verkregen over welke genen (kwalitatief), maar ook in welke mate (kwantitatief) elk gen tot expressie komt.

Hierdoor hebben we een uitgebreid expressieprofiel van huidcellen kunnen genereren dat ongeveer 80.000 geïdentificeerde “tags” omvat. SAGE heeft zo aangetoond dat keratinocyten minstens 15.000 genen tot expressie kunnen brengen, en dat vele van deze genen onder andere coderen voor proteases en proteaseremmers. Onder deze hoog tot expressie komende genen vonden we veel leden van de cystatine-familie. Een relatief hoog tot expressie komend transcript dat in eerste instantie met behulp van genoomdatabases niet kon worden geïdentificeerd als een bestaand gen, werd kort daarna door twee onafhankelijke groepen gekloneerd. Het bleek dat dit cDNA codeerde voor een cysteïne proteaseremmer, cystatine M ofwel cystatine E. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift omvat de moleculaire, biochemische, cellulaire en functionele karakterisering van dit molecuul dat verder wordt aangeduid als cystatine M/E.

Hoofdstuk 1 is de algemene inleiding van dit proefschrift en beschrijft ten eerste de opbouw en structuur van de humane huid, en de rol van de huid in de barrièrefunctie. De gangbare modellen voor samenstelling en opbouw van het stratum corneum worden hier uitgebreid beschreven. De samenstelling van de eiwit- en lipide-envelop, en de rol van transglutaminases in de uiteindelijke assemblage van de zogeheten verhoornde cel-envelop (CE) van de corncocyt worden tevens besproken in hoofdstuk 1. Verder is er een uitgebreide tabel gemaakt van humane ziektes die op één of andere manier een verstoorde epidermale verhoorning als fenotype hebben. Deze tabel laat een nieuwe classificatie zien die gebaseerd is op de biochemische functie van het gemuteerde gen. Vervolgens worden diermodellen besproken met defecten in structurele eiwitten van het CE en/of andere componenten, zoals enzymen, transcriptiefactoren en adhesiemoleculen. Het tweede gedeelte van hoofdstuk l behandelt proteases en hun remmers in huid, en meer in detail de cysteïne proteases en hun bijbehorende remmers van de cystatine-familie. Hoofdstuk 1 eindigt met de beschrijving van de cysteïne proteaseremmer cystatine M/E, “HET” onderwerp van dit proefschrift, en zijn veronderstelde “target” protease in de huid, de asparaginyl-endopeptidase legumain.

Hoofdstuk 2 beschrijft de weefsel-verdeling en biochemische eigenschappen van cystatine M/E. Omdat cystatine M/E hoog tot expressie komt in onze SAGE-analyses van gekweekte keratinocyten hebben we onderzocht of cystatine M/E ook tot expressie komt in humane huid in vivo. We hebben vervolgens op twee manieren recombinant cystatine M/E gemaakt, gebruikmakend van zowel een bacterieel expressiesysteem als baculovirus­systeem. Recombinant cystatine M/E is daarna gebruikt voor het maken van polyclonale antilichamen die we hebben opgewekt in een konijn en in een cavia. Affiniteitgezuiverde polyclonale antilichamen uit het konijn zijn gebruikt voor een expressiestudie op een groot aantal humane weefsels. Hieruit bleek dat cystatine M/E eiwitexpressie is beperkt tot het stratum granulosum van de huid, de haarfollikels, de talgklieren, en de uitscheiding-kanaaltjes en afvoergangen van de eccrine zweetklieren. De aanwezigheid van cystatine M/E in de huid en de afwezigheid van het eiwit in de andere organen hebben we vervolgens ook bevestigd op RNA-niveau door middel van RT­PCR en Northern blotting. Verder biochemisch onderzoek liet zien dat recombinant cystatine M/E biologisch actief is als proteaseremmer, dat het een substraat kan zijn voor crossslinking reacties door transglutaminases, maar dat het geen direct antimicrobieel effect heeft in vitro op enkele geteste huidcommensalen. In vitro studies tonen aan dat cystatine M/E expressie wordt geïnduceerd, zowel op RNA als eiwitniveau, wanneer gekweekte keratinocyten worden gestimuleerd om te gaan differentiëren. We hebben laten zien dat cystatine M/E, dat een signaalpeptide heeft, ook daadwerkelijk wordt uitgescheiden. Met behulp van de polyclonale antilichamen tegen cystatine M/E uit het konijn en de cavia hebben we een sandwich-ELISA ontwikkeld waarmee we cystatine M/E hebben kunnen meten in het supernatant van gekweekte keratinocyten en in vivo in humaan zweet.

Om mogelijke aanwijzingen voor de functie van cystatine M/E te verkrijgen, hebben we de immunohistochcmischc studies uitgebreid naar inflammatoire en neoplastische huidaandoeningen. In hoofdstuk 3 laten we zien dat als gevolg van ontsteking, cystatine M/E expressie wordt geïnduceerd in enkele lagen van het stratum spinosum van de epidermis. In neoplastische epidermis is de expressie van cystatine M/E enkel beperkt tot goed gedifferentieerde cellen en kan als zodanig geen onderscheid maken tussen benigne en (pre)-maligne epidermale neoplastische aandoeningen. Plaveiselcelcarcinomen (PCCs) van de long, en die van het hoofd-/halsgebied lieten geen cystatine M/E expressie zien. Wel opvallend was dat enkel in een PCC van cutane oorsprong cystatine M/E expressie werd waargenomen, wat suggereert dat een cutane omgeving noodzakelijk is voor cystatine M/E expressie. De secretie van cystatine M/E in zweet, de expressie van het eiwit op het scheidingsvlak van het interne en externe milieu (bijvoorbeeld in de bovenste laag van de epidermis en haarfollikels), en de verhoogde expressie onder inflammatoire condities, doet vermoeden dat cystatin M/E betrokken zou kunnen zijn bij de bescherming van de gastheer, de zogeheten “host protection”. Tot nu heeft cystatine M/E echter alleen maar een matige remming van cathepsine B laten zien. We veronderstelden dat cystatine M/E misschien een regulatoire rol zou kunnen spelen tijdens ontsteking en infectie, door het onder controle houden van excessieve endogene en exogene (microbiële) protease-activiteit.

Om de functie van cystatine M/E te achterhalen wilden we in eerste instantie een cystatine M/E knock-out muis genereren, zoals beschreven is in hoofdstuk 4. Daarvoor is eerst het cystatine M/E gen van de muis geïsoleerd en gekarakteriseerd (Cst6, gedeponeerd in de GenBank database, accession no. AY093591). De chromosoomlokalisatie van het muizen cystatine M/E gen is met fluorescentie in situ hybridisatie bepaald op het einde van muizenchromosoom 19. Op basis van de expressie van cystatine M/E in huid en haarfollikels en de lokalisatie van het gen op het einde van muizenchromosoom 19, hebben we de beschikbare literatuur geraad­pleegd, met betrekking tot mutante laboratorium muizenstammen (spontane mutaties) met abnormaliteiten in epidermale differentiatie en haarfollikelmorfologie. Hierbij stuitten wij op een artikel waarin een muizenmodel wordt beschreven dat lijkt op een ernstige huidziekte die bij mensen bekend staat als harlekijn ichthyosis. Het fenotype van deze zogeheten ichq muis laat onder andere een verdikte huid zien, sterk verhoornde haarfollikeluitgangen, en een autosomaal recessieve overerving. Het mutante genlocus is gelokaliseerd in de nabijheid van het einde van muizenchromosoom 19, wat bij ons de vraag opriep of de ichq muis misschien wel eens de cystatine M/E deficiënte muis zou kunnen zijn die wij op het punt stonden zelf te genereren. Vervolgens hebben wij twee heterozygote ichq muizenpaartjes verkregen en van deze muizen de genomische sequentie van het Cst6 locus geanalyseerd. De paartjes zijn in fok gezet en van de fenotypisch normale en mutante nakomelingen is ook het cystatine M/E gen gesequenced. De homozygote mutante muizen bleken een nucleotidedeletie te hebben in exon 1. Deze 42delG deletie verandert het zogeheten “reading frame” wat resulteert in een voortijdig stopcodon op aminozuurpositie 20. De homozygote mutante muizen hebben bij de geboorte echter geen fenotype dat afwijkt van de wildtype nakomelingen. Echter vanaf dag 6, bij het begin van de haarfollikelontwikkeling, ontstaat er een dikke laag compacte schilfers, die als eerste waar te nemen is op de rug. De volgende dagen breidt deze dikke hoornlaag zich uit, en de muizen gaan dood voordat ze 12 dagen oud zijn. Immunohistochemische analyse bevestigt de voorspelde afwezigheid van cystatine M/E eiwit in de homozygote ichq muizen. Heterozygote en wildtype muizen laten een normaal cystatine M/E expressiepatroon zien, wat suggereert dat de aanwezigheid van cystatine M/E essentieel is voor epidermale homeostase en normale haarfollikelmorfogenese. Uit deze data hebben we geconcludeerd dat een inactiverende mutatie in het cystatine M/E gen de oorzaak is van verstoorde verhoorning bij ichq mutante muizen.

Na de ontdekking van Cst6 als het veroorzakende gen van het fenotype in ichq muizen, resteerden enkele belangrijke vragen: is dit ook het geval bij vergelijkbare humane erfelijke huidaandoeningen, en wat is de functie van cystatine M/E in normale epidermale homeostase? De eerste vraag wordt gedeeltelijk beantwoord in hoofdstuk 5. We hebben eerst het humane cystatine M/E gen bij de mens gecompleteerd en de sequentie gedeponeerd in de publieke database (CSM’, GenBank database, accession no. AY145051). De betrokkenheid van cystatine M/E in één kandidaat-ziekte (een lethale vorm van ichthyosis) bij mensen is onderzocht door mutatieanalyse uit te voeren op 11 sporadische harlekijn ichthyosis (HI) patiënten. In deze groep van patiënten zijn echter geen mutaties gevonden. Verstoorde transcriptie of translatie die te wijten zou kunnen zijn aan mutaties in regulerende en niet-coderende regio’s van cystatine M/E is niet waarschijnlijk. Met immunohistochemie op huidbiopten hebben we een normale cystatine M/E eiwitexpressie aan kunnen tonen bij deze patiënten. Het is echter niet uitgesloten dat voor andere vormen van ichthyosis en/of huidziekten met verstoorde epidermale homeostase, cystatine M/E het veroorzakende gen kan zijn. Momenteel wordt een grote groep van zulke patiënten gescreend met behulp van immunohistochemie op afwezigheid van cystatine M/E in hun huid. Dit onderzoek gebeurt in samenwerking met collega’s van de Universiteit van Munster in Duitsland.

In hoofdstuk 6 beschrijven we hoe de afwezigheid van cystatine M/E de epidermale abnormaliteiten in de ichq muizen veroorzaakt. Tot nu toe was nog steeds niet duidelijk wat de biologische functie is van cystatine M/E en zijn veronderstelde rol in epidermale homeostase. Identificatie van mogelijke targetprotease(s) zou hierin opheldering kunnen brengen. Met experimentele gegevens laten we zien dat het transepidermaal waterverlies van cystatine M/E deficiënte muizen verhoogd is ten opzichte van fenotypisch normale nestgenoten. Het afgenomen lichaamsgewicht van de ichq mutante muizen, opnieuw vergeleken met fenotypisch normale nestgenoten, ondersteunt het vermoeden dat deze muizen overlijden door dehydratie. Met behulp van enzymassays, specifieke substraten, en synthetische proteaseremmers, hebben we de asparaginyl­endopeptidase legumaine als targetprotease van cystatine M/E in huid kunnen identificeren. Onder normale omstandigheden is cystatine M/E in de huid aanwezig wat waarschijnlijk essentieel is voor de regulatie van legumaine protease-activiteit. Dit hebben we kunnen bevestigen met behulp van een door ons ontwikkelde assay waarmee het mogelijk is om in situ vrije legumaine-activiteit te visualiseren als een fluorescerend precipitaat. Met deze assay hebben we vrije legumaine-activiteit kunnen aantonen in de haarfollikels en in de huid van cystatine M/E deficiënte muizen, op plaatsen waar cystatine M/E normaliter tot expressie komt. Wildtype nestgenoten laten geen vrije in situ legumaine activiteit zien, wat suggereert dat de vrije legumaine-activiteit in de huid van deze ichq muizen dus direct, of indirect, verantwoordelijk is voor de verstoorde barrièrefunctie. Deze bevinding is het eerste bewijs dat cystatin M/E en legumaine een functionele biologische twee-eenheid vormen in de huid, en hierbij hebben we dus een nieuw protease-antiprotease systeem ontdekt. Hierbij komen echter nieuwe vragen naar boven: wat is de functie van vrije cellulaire legumaine­activiteit? Welke eiwitten worden geprocessed door vrije legumaine-activiteit? Welke biologische processen worden door legumaine gereguleerd, en welke processen worden verstoord door ongeremde legumaine-activiteit, wat waarschijnlijk het geval is in de cystatin M/E deficiënte muizen? Verder biochemisch onderzoek aan cystatine M/E deficiënte muizen heeft aangetoond dat in de huid van deze muizen verminderde hoeveelheden loricrine-monomeren en loricrine-dimeren bevatten. Loricrine is het hoofdbestanddeel van de CEs, die worden gevormd tijdens terminale differentiatie van keratinocyten. We hebben kunnen laten zien dat de verstoorde cornificatie in de cystatine M/E deficiënte muizen waarschijnlijk wordt veroorzaakt door afwijkende processing van loricrine, wat het resultaat is van abnormale TGase 3 activatie door cathepsines, die op hun beurt kunnen worden gereguleerd door legumaine. Deze data suggereren dat verstoring van de balans tussen legumaine en cystatine M/E in huid leidt tot een beschadigde barrièrefunctie, waardoor cystatine M/E deficiënte muizen sterven aan uitdroging.

print