Auteur: I.B.J.G. Debats
Promotiejaar: 2011
ISBN-13: 978-94-6159-076-3
Samenvatting en conclusie
De huid is onze belangrijkste barrière tegen schadelijke invloeden van buitenaf. Tevens helpt ze ons in de communicatie met onze omgeving. Wanneer de huid beschadigd is, wordt een complexe cascade van herstelmechanismen in gang gezet om haar functie te herstellen. Dit goed uitgebalanceerde proces wordt beïnvloed door vele mediatoren. Hoewel onderzoek met betrekking tot wondgenezing heeft geleid tot vele nieuwe therapeutische interventies, blijft vertraagde wondgenezing een zware last voor de patiënt en de samenleving. Voeding is van essentieel belang voor een adequate wondgenezing, waarbij aminozuren de bouwstenen zijn. Aminozuren zijn de bouwstenen van onze voeding. Dit proefschrift beschrijft de rol van het aminozuur arginine als immunonutriënt, bij de genezing van chirurgische en chronische wonden bij mensen. Onze hypothese is dat arginine suppletie humane wondgenezing zal verbeteren.
In het eerste hoofdstuk wordt een literatuuroverzicht van de huidige kennis over de rol van arginine in de wondgenezing gepresenteerd. Uit dierproeven blijkt dat arginine een belangrijke voedingsstof is voor het herstel van de huid. Als immunonutrient verbetert arginine de wondgenezing aanzienlijk. Ook de resultaten van enkele vroege studies met experimentele humane wonden waren veelbelovend. Naar aanleiding van deze resultaten vond suppletie van arginine al snel haar weg naar de kliniek. De daaropvolgende klinische studies vertoonden echter nogal wat beperkingen. Zo bevatten de toegediende voedingssupplementen naast arginine ook andere bestanddelen zoals nucleotiden en omega-3-vetzuren. Vaak ontbrak een goede controlegroep, gesuppleerd met isonitrogene en/of isocalorische hoeveelheden aminozuren. Moest het effect van deze behandelingen toegeschreven worden aan de specifieke immunonutriënten of aan de toevoeging van aminozuren en/of calorieën in het algemeen? Bovendien werden indirecte parameters gebruikt om de wondgenezing te evalueren zoals infectie of het pijnvrij verwijderen van verbandmiddelen. Deze beperkingen maakten het moeilijk conclusies te trekken uit deze studies.
De eerste stap voor dit proefschrift was het toetsen van de hypothese dat de menselijke huid arginine gebruikt. Hoofdstuk 2 beschrijft te resultaten van de transorgane meting van arginine metabolisme in de huid. Dit werd ons mogelijk gemaakt doordat plastische chirurgie gebruik maakt van zogenaamde vrij gevasculariseerde weefsel transplantatie, waarbij het huidmetabolisme relatief geïsoleerd bestudeerd kan worden. Tot nu toe werd arginine metabolisme indirect beoordeeld. Echter voor onze studie werden gelabelde aminozuren (isotopen) gebruikt. Patiënten die een borstreconstructie ondergingen middels een vrij gevasculariseerde huidlap, genaamd Deep Inferior Epigastric Artery flap (DIEP-lap) werden geïncludeerd. Tijdens deze operatie werd een arginine tracer (15N2-arginine) toegediend en tevens werd bloed afgenomen uit de ader en slagader van de DIEP-lap. Een significante opname van 15N2-arginine (p <0,05) werd waargenomen. Hoewel we de enzymatische omzetting naar 15N citrulline of 15N2 ureum niet konden aantonen, kunnen we uit de arterioveneuze concentratieverschillen van citrulline en ornithine opmaken dat de huid deze aminozuren produceert. Omdat geen van beide aminozuren vrijkomt uit eiwitafbraak, moeten deze endogeen gegenereerd zijn in de huid door respectievelijk NOS en ASE-activiteit. Ondanks dat de tracer data duidelijk aantonen dat er arginine opname door de huid plaatsvindt, werd een netto arginine release waargenomen. In lijn met de netto release van de meeste andere aminozuren kan deze bevinding toegeschreven worden aan netto eiwitafbraak in deze katabole patiënten. Een opmerkelijk bevinding was dat het aminozuur glutamaat als enige een netto opname vertoonde.
De volgende stap was het bestuderen van de expressie van enzymen die betrokken zijn bij arginine metabolisme in zowel de normale huid als in de huid met chirurgische wonden. Hierbij werd een verhoogde expressie in chirurgische wonden ten opzichte van normale huid verwacht. Hoofdstuk 3 beschrijft de resultaten van onze immunohistologische studie, waarbij biopten van wonden gedurende een periode van tien dagen na de operatie werden bestudeerd. We constateerden toegenomen expressie van induceerbaar stikstofoxide synthetase (iNOS) in macrofagen, polymorfonucleaire neutrofielen (PMN’s), fibroblasten, keratinocyten en endotheelcellen in deze chirurgische wonden vergeleken met normale huid. Verder constateerden we een basale expressie van endotheliale stikstofoxidesynthetase (eNOS) in bloedvaten van de normale huid. In de wonden echter werd een verhoogd aantal bloedvaten waargenomen die tevens iNOS tot expressie brachten. Zowel de arginase isovormen, arginase-1 (ASE1) en arginase-2 (ASE2) bleken tot expressie te komen tijdens de wondgenezing. ASE1 komt alleen tot expressie in neutrofielen na verwonding, terwijl ASE2-aankleuring wordt waargenomen in endotheelcellen, keratinocyten, fibroblasten, macrofagen en PMN’s.
In aanvulling op immunohistologische evaluatie van wonden, werden de waarden van arginine metabolieten gemeten in wondvocht en plasma. Hieruit kan men indirect arginine metabolisme afleiden. Er werden verhoogde waarden citrulline, nitriet / nitraat (NOx) en ornithine gemeten in wondvocht ten opzichte van plasma. Waarden van ASE1 waren significant hoger in wondvocht in vergelijking met plasma, terwijl de waarden van ASE2 hoger waren in het plasma. Deze waarnemingen suggereren arginine verbruik tijdens de humane wondgenezing. Om een potentiële verklaring te vinden voor de verstoorde heling van chronische wonden wordt in hoofdstuk 4 de expressie van arginine metabolieten en metaboliserende enzymen in chronische wonden vergeleken met chirurgische wonden. Aangezien infectie het beloop van wondgenezing negatief beïnvloed, werd tevens de relatie tussen de aanwezigheid van een infectie en arginine-omzetting bestudeerd. Derhalve hebben we de chronische wonden in twee subgroepen verdeeld, te weten de niet- geïnfecteerde en de geïnfecteerde. Enkele significante verschillen werden waargenomen. Ten eerste, geïnfecteerde chronische wonden laten significant verhoogde citrulline en ornithine waarden zien in wondvocht ten opzichte van chirurgische wonden. Aangezien deze aminozuren niet uit eiwitafbraak vrijkomen, suggereert deze verhoging een toegenomen omzetting van arginine door de enzymen NOS en ASE. Deze suggestie wordt ondersteund door de bevinding dat deze geïnfecteerde wonden significant hogere ASE1 concentratie bevatten. Er werden echter verlaagde waarden van NOx waargenomen in wondvocht van geïnfecteerde chronische wonden, hetgeen kan duiden op een verminderde aanmaak of verhoogd verbruik van stikstofmonoxide. Een NO deficiëntie kan nadelig zijn voor de afweer reactie. In tegenstelling tot de andere twee subgroepen werd er in de groep patiënten met geïnfecteerde chronische wonden verlaagde plasma argininespiegels geconstateerd. Aangezien er geen verschil was in systemische metabole of inflammatoire status tussen de subgroepen patiënten, wijzen deze bevindingen op het feit dat toegenomen lokaal verbruik van arginine in chronisch geïnfecteerde wonden leidt tot een verlaging van systemische arginine spiegels.
In hoofdstuk 5 worden de resultaten van een pilotstudie beschreven. De opzet van de studie was een dubbelblinde gerandomiseerde klinische studie die het effect van orale arginine-suppletie, als mononutriënt, op de genezing van donorsites (van huidtransplantaten) bestudeert. De wondgenezing werd geëvalueerd door het meten van PMN-instroom, neovascularisatie en reëpithelialisatie. In zowel de controle als gesuppleerde groep werd een gelijke NOS en ASE-activiteit waargenomen in het wondmilieu. Patiënten in de arginine-groep, toonden geen verbetering van de wondgenezing.
In hoofdstuk 6 werd gepoogd de mogelijke beperkingen van de eerder uitgevoerde pilotstudie te verbeteren door de studiepopulatie te vergroten en arginine intraveneus toe te dienen. Hetzelfde wondmodel en dezelfde parameters werden bestudeerd. Beide groepen waren vergelijkbaar in leeftijd, nutritiële, metabole en inflammatoire status. Een adequate stijging van het plasma arginine werd na suppletie waargenomen. Een gunstig effect op de wondgenezing bleef echter uit.
Definitieve conclusies en toekomstperspectieven
De expressie van NOS-isovormen en argininemetabolieten in chirurgische wonden zoals beschreven in dit proefschrift ondersteunt de eerdere experimentele studies waaruit blijkt dat het herstel van beschadigde huid gereguleerd wordt door NO. Daarnaast werd arginase expressie waargenomen tijdens de wondgenezing. Eerdere studies toonden een verhoging van ASE1 in dierlijke wondgenezing en een overexpressie van ASE1 in pathologische huidaandoeningen bij mensen aan. Echter, onze resultaten tonen een meer prominente rol van ASE2 in normale humane wondgenezing. Het is niet ondenkbaar dat verschillende typen wonden verschillende behoeften aan voedingsstoffen hebben op verschillende tijdstippen. Onze studie over chronische wonden ondersteunt deze hypothese door een verhoogde arginine conversie aan te tonen in vergelijking met chirurgische wonden. Verder werd een NO- deficiëntie waargenomen in de geïnfecteerde chronische wonden, mogelijk verantwoordelijk voor de gebrekkige afweer, aangezien NO wordt gebruikt door verschillende inflammatoire cellen. Een tekort aan NO zou ook veroorzaakt kunnen worden door bacteriële arginine consumptie. Een andere verklaring kan gezocht worden in een proces genaamd “substraat competitie” en bekend van in-vitro experimenten. Dit is een verstoring van het evenwicht in NOS en ASE expressie, waarbij één van beide metabole routes de overhand krijgt. Deze verstoring kan dan invloed hebben op de beschikbaarheid van arginine. Verder was het opmerkelijk dat patiënten met geïnfecteerde chronische wonden verlaagde plasma arginine spiegels vertoonden. Verlaging van de systemische arginine spiegels wordt ook gezien bij patiënten die zijn blootgesteld aan een trauma, brandwonden of operatie en deze verlaging is niet bevorderlijk voor het immuunsysteem. Onze verschillende subgroepen patiënten lieten geen verschil zien in systemische inflammatoire response, voedingstoestand of comorbiditeit. Derhalve zijn wij van mening dat een verlaagde plasma arginine spiegel toegeschreven kan worden aan een verhoogde lokale metabole behoefte ten gevolge van een infectie.
Een andere belangrijke conclusie van dit proefschrift is dat arginine-suppletie de wondgenezing in acute chirurgische (schaaf)wonden niet verbetert. Dit staat in schril contrast met experimentele studies. Als wondmodel gebruikten we de donorsite van de huidtransplantaten. Het voordeel van dit model is dat het homogeen is en gemakkelijk toegankelijk. Nadeel kan zijn dat deze voornamelijk gebruikt kan worden om reëpithelialisatie te bestuderen. Hoewel het een klinisch relevant wondmodel is, geneest een donorsite snel onder normale omstandigheden, wat een reden kan zijn dat verschillen moeilijk waar te nemen zijn. De bevindingen van deze studie sluiten niet uit dat arginine suppletie potentieel meer effect heeft op andere typen wonden.
Mogelijk toekomstig onderzoek kan zich richten op de behoefte aan arginine in de verschillende fasen van wondgenezing. In diermodellen is reeds een sequentiële activering van de verschillende metabole routes van arginine waargenomen. Dit kan duiden op een tijdsafhankelijke behoefte aan verschillende arginine metabolieten. Daarnaast zou lokale applicatie van arginine kunnen worden onderzocht, aangezien het aanbrengen van een NO-donor op wonden in de vorm van een crème een gunstig effect heeft op experimentele wondgenezing. Citrulline suppletie kan eveneens onderzocht worden. Hoewel arginine plasmaspiegels adequaat stegen na suppletie, werden ook hoge plasmaspiegels van ornithine waargenomen. De omzetting van arginine door het gastro-intestinale kanaal dient hiervoor verantwoordelijk te worden gehouden. Citrulline is een natuurlijke precursor voor L-arginine en het wordt omgezet in arginine in vele weefsels. Citrulline omzeilt het metabolisme in de lever en is geen substraat of inductor van arginase. Verhoogde argininespiegels in plasma en tegelijkertijd inductie van het bioactieve NO zijn reeds aangetoond na citrulline suppletie. Tot slot kunnen we van onze studie met stabiele isotopen concluderen dat arginine consumptie door de huid niet een substraatgedreven proces is. Het lijkt daarom meer logisch te focussen op manipulatie van expressie van arginine-metaboliserende enzymen in wonden in plaats van substraat te suppleren. Ondanks de positieve experimentele data, is er meer behoefte aan klinische studies om de rol van arginine beter te definiëren in de zorg voor patiënten.