2012_Proefschrift_Lammers, G. Auteur: G. Lammers
Promotiejaar: 2012
ISBN-13: 978-90-8570-765-3

Samenvatting 
De huid is het grootste orgaan van het menselijk lichaam en speelt een belangrijke rol in de afweer tegen ziekteverwekkers, de regulatie van de lichaamstemperatuur en het voorkomen van uitdroging. Indien de huid beschadigd raakt is het zaak deze functies zo snel mogelijk te herstellen. In het geval van grote (brand)wonden gaat dit meestal gepaard met contractie en littekenvorming. Dit is ongewenst, aangezien littekens vaak afwijken van de omringende gezonde huid wat betreft kleur en functie en ze rondom gewrichten de mobiliteit kunnen beperken. Een mogelijke oplossing van dit probleem is het gebruik van tissue engineering/regeneratieve geneeskunde.

Tissue engineering is een interdisciplinair vakgebied dat de principes van levenswetenschappen en technologie aanwendt om biologische substituten te ontwikkelen die de functie van weefsels repareert, behoudt of verbetert. Kort samengevat is tissue engineering dus het “bouwen van weefsels”. Onze aanpak om beschadigde huid te genezen is door middel van het implanteren van een construct (zonder cellen) dat de natuurlijke huid zo veel mogelijk nabootst. Als basismateriaal hiervoor wordt het belangrijkste structurele eiwit van de huid gebruikt, collageen type I. Dit kan worden gecombineerd met bijvoorbeeld elastine en biologisch actieve suikers (glycosaminoglycanen) en groeifactoren, die elk hun specifieke rol spelen in de biologie van de huid. Het construct wordt vaak verstevigd door middel van een crosslink methode die tegelijkertijd het koppelen van glycosaminoglycanen mogelijk maakt.

Na een algemene introductie (hoofdstuk 1) begint dit proefschrift in hoofdstuk 2 met een overzicht van methoden die momenteel in de kliniek gebruikt worden om littekenweefsel te evalueren. Dit wordt gevolgd door een uitgebreid overzicht van methoden die in de literatuur beschreven zijn om tissue-engineered huidconstructen in diermodellen te evalueren. Opvallend is dat hiervoor een groot aantal verschillende evaluatiemethoden, dier- en wondmodellen gebruikt worden. Standaardisatie is noodzakelijk om een goede vergelijking tussen verschillende studies mogelijk te maken. Hierna volgt een aantal hoofdstukken waarin verschillende aspecten worden belicht die nodig zijn om tot de ontwikkeling van een huidconstruct te komen. Het glycosaminoglycaan heparine wordt vaak in tissue-engineered constructen ingebouwd.

Hoofdstuk 3 beschrijft zeven verschillende methoden die gebruikt kunnen worden om de hoeveelheid en activiteit van dit ingebouwde heparine te analyseren. De resultaten maken duidelijk dat de gekozen methode en de voorbehandeling van het biomateriaal van groot belang zijn voor een goede analyse. Ook wordt bevestigd dat het belangrijk is om de crosslinkcondities te controleren, aangezien dit een groot effect kan hebben op de hoeveelheid gebonden heparine en de activiteit hiervan.

In hoofdstuk 4 wordt de ontwikkeling beschreven van een celkweekopzet om in één keer een groot aantal variaties van een biomateriaal te kunnen testen. Als voorbeeld wordt de groei geëvalueerd van opperhuidcellen (keratinocyten) op 48 verschillende moleculair gedefinieerde collageenmembranen. Deze modificaties laten een duidelijk effect op de celgroei zien en bijvoorbeeld de toevoeging van elastine vezels blijkt de groei van keratinocyten te stimuleren. Door nieuw ontwikkelde materialen eerst in een dergelijk celkweeksysteem te screenen kunnen vervolgens enkel de meest veelbelovende in diermodellen worden geëvalueerd. Deze aanpak kan het aantal gebruikte proefdieren verminderen. Het wondgenezingsproces kan vertraagd worden door de langzame vorming van nieuwe bloedvaten waardoor het weefsel te weinig zuurstof en voeding krijgt. Vasculair endotheel groeifactor (VEGF) is een eiwit dat kan worden gebruikt om deze bloedvatvorming te stimuleren.

In hoofdstuk 5 wordt het kloneren, de productie en zuivering van actief rat VEGF beschreven. Dit gezuiverde eiwit kan vervolgens in huidconstructen worden geïncorporeerd.

In hoofdstuk 6 wordt de ontwikkeling van een geavanceerd dubbellaags huidconstruct beschreven, bestaande uit moleculair gedefinieerde componenten als collageen type I, elastine, glycosaminoglycanen en groeifactoren. Tevens wordt beschreven hoe dit construct in een rat wondmodel is geïmplanteerd en wordt het vergeleken met een commercieel verkrijgbaar huidconstruct (Integra) en onbehandelde wond. Op vroege tijdstippen leidt de toepassing van dit dubbellaags construct tot minder wondcontractie, de vorming van meer bloedvaten en een hogere infiltratie van cellen. Op de lange termijn blijkt er meer vorming van elastinevezels plaats te vinden. Toepassing van dit construct leidt dus tot (tijdelijke) verbetering van verschillende aspecten van het wondgenezingsproces. In de daarop volgende hoofdstukken ligt de focus op de ontwikkeling van een nieuwe methode om wondgenezing te evalueren en op de constructie van een innovatief biomateriaal.

In hoofdstuk 7 wordt de wondgenezing na toepassing van het dubbellaags construct uit hoofdstuk 6 geëvalueerd met behulp van genexpressie microarrays. Het achterliggende idee is dat ieder gen codeert voor een eiwit met een specifieke biologische functie en dat het expressieniveau van ieder gen correleert met de hoeveelheid geproduceerd eiwit. Door gelijktijdig de expressieniveaus voor alle bekende genen (tijdens deze studie -8.000 voor de rat) te analyseren wordt getracht inzicht te verkrijgen in de rol van verschillende biologische processen tijdens wondgenezing. Lijsten van genen met veranderde expressie worden geanalyseerd en biologische processen worden geïdentificeerd die verhoogd of juist verminderd plaats vinden in de regenererende huid. Bevestiging van deze observaties met (immuno)histologische technieken toont aan dat deze snelle en objectieve aanpak geschikt is als alternatieve evaluatiemethode.

Tot slot wordt in hoofdstuk 8 de productie beschreven van een membraan dat de driedimensionale structuur van de papillaire dermis in de huid nabootst. Het is mogelijk keratinocyten te kweken op deze membranen. Rondom de basis van de microstructuren op deze membranen zijn cellen met een afwijkende morfologie te zien. Het gaat hier waarschijnlijk om jonge, minder gedifferentieerde keratinocyten. Genexpressieanalyse met behulp van microarrays wijst op de gestructureerde membranen in de richting van processen als migratie en proliferatie, terwijl op vlakke membranen meer differentiatie optreedt. Door de driedimensionale omgeving aan te passen is het dus mogelijk om cellen in een bepaalde richting te sturen.

Toekomstvisie
Voor toekomstige studies kan de in vitro celkweektest uit hoofdstuk 4 worden uitgebreid door toevoegingen te combineren (zoals de veelbelovende combinatie van collageen type IV en elastine vezels), nieuwe componenten toe te voegen (bijvoorbeeld groeifactoren, zoals geproduceerd in hoofdstuk 5), andere typen scaffold te gebruiken (bijvoorbeeld poreuze scaffolds of het gestructureerde membraan uit hoofdstuk 8) en andere celtypen te evalueren. Keratinocyten zullen tijdens de kweek ook aan de lucht blootgesteld worden, aangezien dit de natuurlijke situatie beter benadert. Ook is het interessant om alternatieve uitleesmethoden zoals genexpressie microarrays te gebruiken om de cellulaire reactie op verschillende moleculair gedefinieerde biomaterialen te analyseren.

Door het gestructureerde membraan van hoofdstuk 8 als toplaag voor een construct te gebruiken kan deze mogelijk worden verbeterd. Aan deze epidermale laag kunnen elastinevezels worden toegevoegd, aangezien in hoofdstuk 4 werd aangetoond dat deze keratinocytgroei stimuleren. Uiteraard zullen bij in vivo evaluatie van deze vernieuwde constructen de aanbevelingen van hoofdstuk 2 in acht worden genomen. Daarnaast zullen de ontwikkelingen op het gebied van histologische kwantificatie nauwlettend worden gevolgd en, indien geschikt, worden geïmplementeerd.

In combinatie met de standaardisatie van dier- en wondmodellen zal dit een betere vergelijking tussen constructen mogelijk maken en leiden tot een kortere preklinische onderzoeks- en ontwikkelingsfase. Genexpressie microarrays zullen spoedig gebruikt worden als snelle en onbevooroordeelde methode om andere tissue-engineered huidconstructen en/of organen te analyseren. De interpretatie van onze resultaten in hoofdstuk 7 werd belemmerd door een combinatie van de onvolledigheid van de onderliggende genontologie (GO) termen en relatief beperkte annotatie van het rattengenoom. Verdere ontwikkeling van deze termen en annotaties zullen daarom, in combinatie met de beschikbaarheid van nieuwe analysemethoden, de interpretatie van microarrayresultaten verbeteren. Daarnaast zullen nieuwe technieken een snellere, goedkopere en meer grondige analyse mogelijk maken. Next generation sequencing is bijvoorbeeld veelbelovend om RNA expressieniveaus nog betrouwbaarder te detecteren.

Een beter begrip van het herstelproces zal leiden tot de identificatie van nieuwe belangrijke spelers in wondgenezing. Net zoals VEGF in hoofdstuk 5 kunnen andere interessante biologisch actieve moleculen worden gekloond en geproduceerd voor verdere evaluatie. Daarnaast maakt de beschikbaarheid van de VEGF expressievector het mogelijk om dit eiwit moleculair te verbinden aan signaalmoleculen zoals green fluorescent protein (GFP) om op deze manier bijvoorbeeld de in vitro en in vivo distributie van het eiwit te onderzoeken. Uiteindelijk zal deze aanpak hopelijk resulteren in een toekomst waarin een patiënt met brandwonden, acute wonden of een moeilijk helende zweer het ziekenhuis binnen komt, de chirurg een betaalbaar construct van de plank pakt, het in de juiste vorm knipt en op het wondgebied legt, waarna het construct direct de beschermende rol van de huid vervult en het regeneratieproces dirigeert naar een spoedig herstel van de originele huid.

print