2014_Proefschrift_Duitman, J. Auteur: JanWillem Duitman
Promotiejaar: 2014

Proefschrift beschrijft (o.a.) resultaten van project : 9.102 –  gefinancierd door de Nederlandse Brandwonden Stichting

Samenvatting
In Hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de tot nu toe bekende functies van C/EBPδ waarbij de focus vooral op de rol van C/EBPδ in de ontstekingsrespons, celdeling en celdood ligt omdat deze processen het meest van belang zijn voor de verschillende studies die in dit proefschrift zijn opgenomen. De kennis over C/EBPδ, specifiek in infectieziekten, wordt in de verschillende hoofdstukken van deel 1 van dit proefschrift verder uitgebreid. In Hoofdstuk 2 is de rol van C/EBPδ in experimentele pneumokokken pneumonie (i.e. meest voorkomende veroorzaker van longontsteking) onderzocht. Hier laten we zien dat C/EBPδ het verloop en de uitkomst van Streptococcus pneumoniae geïnduceerde longinfectie verergerd door regulatie van een Plateled-Activating Factor Receptor afhankelijk mechanisme. C/EBPδ deficiënte muizen waren beschermd tijdens een door pneumokokken veroorzaakte longinfectie wat zichtbaar was in verminderde verspreiding van de bacteriën van de longen naar het bloed en een langere overlevingstijd. Vervolgens hebben we in Hoofdstuk 3 de rol van C/EBPδ tijdens een door de gram negatieve bacterie Klebsiella pneumoniae (i.e. meest voorkomende veroorzaker van longontsteking opgelopen in het ziekenhuis) veroorzaakte longinfectie onderzocht om te kijken of C/EBPδ tijdens deze infectie ook een schadelijke rol speelt. We laten echter zien dat C/EBPδ juist van cruciaal belang is tijdens een longinfectie veroorzaakt door Klebsiella pneumoniae. Dit blijkt uit een veel kortere overlevingstijd van C/EBPδ deficiënte muizen na longinfectie met de Klebsiella bacterie en onze hypothese naar aanleiding van alle onderzochte parameters in deze studie is dat de verminderde macrofaag mobilisatie in C/EBPδ deficiënte muizen één van de belangrijkste
oorzaken van deze verhoogde mortaliteit is. Kort nadat wij onze onderzoeksresultaten uit hoofdstuk 3 hadden gepubliceerd verscheen er in artikel over de rol van C/EBPδ tijdens steriele longontsteking met op het eerste gezicht tegenstrijdige onderzoeksresultaten. Hoofdstuk 4
bediscussieert de resultaten beschreven in hoofdstuk 2 en 3 in het licht van deze recente publicatie en beredeneert mogelijke verklaringen over de precieze rol van C/EBPδ tijdens longinfectie en de ontstekingsreactie. We concluderen dat C/EBPδ een belangrijke rol speelt tijdens de
ontstekingsreactie, maar dat deze rol complex is en dat we lang nog niet alles begrijpen. Het is daarom belangrijk dat we voorzichtig moeten zijn met het extrapoleren van de onderzoeksresultaten naar de humane situatie en dat de klinische relevantie nader onderzocht moet
worden. In Hoofdstuk 5 wordt onderzocht of C/EBPδ een belangrijke rol speelt bij een door Escherichia Coli veroorzaakte urineweg infectie en beschrijft het effect van C/EBPδ deficiëntie in een specifiek muizenmodel voor acute urineweginfectie. Uit de resultaten die worden beschreven blijkt dat C/EBPδ geen belangrijke rol speelt tijdens deze infectie wat blijkt uit een zelfde bacteriële klaring in wildtype en C/EBPδ deficiënte muizen. Het laatste hoofdstuk van deel 1 van dit proefschrift focust op de rol van C/EBPδ in nierfibrose in een muizenmodel. In dit hoofdstuk (Hoofdstuk 6) laten we zien dat C/EBPδ een beschermende rol speelt tijdens nierfibrose wat blijkt uit meer tubulaire schade, collageen afzetting in het interstitiële weefsel, en hogere TGF-β productie in de nieren van C/EBPδ deficiënte muizen in vergelijking met wildtype muizen. Een aantal mogelijke mechanismen (waaronder macrofaag influx en de balans tussen delende en afstervende cellen) die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor dit verschil werden onderzocht, maar bleken niet de oorzaak van de beschermende rol te zijn.
Het tweede deel van dit proefschrift draagt bij aan onze kennis over de rol van een aantal verschillende familieleden van de familie van protease geactiveerde receptoren (PARs) tijdens fibrotische ziektebeelden. Zowel voor PAR-1 als PAR-2 is al beschreven dat ze, onder andere in de long en de lever, bijdragen aan intracellulaire processen die zorgen voor overmatige extracellulaire matrix productie. Een overzicht hiervan wordt gegeven in Hoofdstuk 7. Vervolgens wordt in Hoofdstuk 8 de resultaten weergegeven van een experiment waarin PAR-1 signalering werd geremd met een specifieke remmer vóór en ná het induceren van longfibrose. Het remmen van PAR-1 signalering leidde tot een vermindering van longfibrose, zelfs als het in een later stadium werd toegediend (7 dagen na inductie van de longfibrose). De resultaten van dit hoofdstuk zijn bijzonder interessant omdat ze aantonen dat het remmen van PAR-1 een mogelijke therapeutische
interventie is voor de behandeling van longfibrose. In Hoofdstuk 9 hebben we geprobeerd de rol van PAR-4 in longfibrose op te helderen. De resultaten lieten zien dat zowel wildtype als PAR-4 deficiënte muizen longfibrose ontwikkelden, maar dat er geen verschillen waren in de mate van fibrose of de hoogte van de fibrotische symptomen zoals collageen en fibronectine productie in PAR-4 deficiënte en wildtype muizen. Samenvattend laten deze resultaten zien dat PAR-4 geen belangrijke rol speelt in longfibrose.
In Hoofdstuk 10 is de bijdrage van PAR-1 in de ontwikkeling van huidfibrose (veroorzaakt door brandwonden of beschadiging) onderzocht en is geprobeerd het onderliggende mechanisme dat leidt tot verdikking van de huid na PAR-1 activatie te ontrafelen. We laten zien dat PAR-1 bijdraagt aan het ontstaan van huidfibrose in een muizenmodel wat blijkt uit verminderde toename in huiddikte en extracellulaire matrix productie in PAR-1 deficiënte muizen in vergelijking met wildtype muizen. We suggereren in dit hoofdstuk dat PAR-1 vooral bijdraagt
aan de fibrotische response door zijn rol in de vermeerdering van het aantal fibroblasten en extracellulaire matrix productie. Vervolgens proberen we in Hoofdstuk 11 de rol van PAR-2 in de ontwikkeling van huidfibrose (veroorzaakt door brandwonden of beschadiging) op te
helderen. Genetische verwijdering van PAR-2 leidde tot antifibrotische effecten en verminderde toename van de huiddikte, fibroblast proliferatie en extracellulaire matrix productie tijdens door bleomycine geïnduceerde huidfibrose. Middels in vitro experimenten laten we zien dat PAR-2 bijdraagt aan de fibrotische response in huidfibroblasten door het stimuleren van celdeling en extracellulaire matrix productie en we suggereren dat deze processen ook de belangrijkste mechanismen zijn waardoor PAR-2 bijdraagt aan huidfibrose in vivo.

Algemene discussie
In het eerste deel van dit proefschrift hebben we getracht meer inzicht te krijgen in de rol die C/EBPδ speelt in de ontstekingsreactie vooral tijdens infectieziekten. C/EBPδ is algemeen geaccepteerd als transcriptiefactor die de ontstekingsreactie positief beïnvloed en verschillende
studies laten zien dat C/EBPδ mogelijk voor genactivatie van verschillende pro-inflammatoire cytokines zorgt. Het is inderdaad zo dat na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS), zowel systemisch als intranasaal toegediend, C/EBPδ deficiëntie tot een verminderde ontstekingsreactie leidt wat blijkt uit lagere cytokine productie (zowel IL-6 als TNF-α) zoals beschreven (resultaten niet weergegeven) in hoofdstuk 4 en referenties 1 en 2.1;2 Hoewel de ontstekingsreactie een sleutelrol speelt in de afweerreactie tijdens een bacteriële infectie, kan een overmatige of langdurige ontstekingsreactie in de verschillende weefsels van het lichaam leiden tot weefsel schade die uiteindelijk leidt tot orgaanfalen en mortaliteit. Onze bevinding dat C/EBPδ beschermd tijdens een door Klebsiella veroorzaakte longinfectie suggereert dat dit mogelijk veroorzaakt wordt door de regulatie van de ontstekingsreactie. Verrassend konden we echter geen positieve regulerende rol voor C/EBPδ in de productie van cytokines vinden die verantwoordelijk kon zijn voor het verschil in uitkomst na infectie. Wel vonden we een verlaagde macrofaag influx in de longen van C/EBPδ deficiënte muizen en we suggereren dat dit proces verantwoordelijk is voor het gevonden verschil in overleving na Klebsiella veroorzaakte longinfectie. Aan de andere kant laten we zien dat C/EBPδ het verloop van een door Streptococcus pneumoniae veroorzaakte longontsteking juist verergert. Hoewel dit resultaat in eerste instantie in tegenspraak lijkt met de hiervoor genoemde resultaten is dit fenotype te verklaren door de specifieke rol die C/EBPδ speelt in de regulatie van de Platelet Activating Factor receptor (de receptor die door de Streptococcus pneumoniae bacterie wordt misbruikt om het organisme binnen te komen) expressie in longepitheel cellen. Daarom is de relatieve immuniteit van C/EBPδ deficiënte muizen tegen Streptococcus pneumoniae veroorzaakte longontsteking niet gerelateerd aan de rol van C/EBPδ in het immuunsysteem en kan er aan de hand van deze resultaten geen conclusie getrokken worden over de rol van C/EBPδ in cytokine productie omdat de hoeveelheid bacteriën in de verschillende organen in dit experiment de cytokine productie al sterk beïnvloed. Het is erg opvallend dat ook tijdens een door Escherichia coli veroorzaakte acute urineweginfectie geen verschillen in cytokine productie werden gemeten tussen C/EBPδ deficiënte muizen en wildtype muizen. Dit is extra interessant in het licht van een eerder beschreven studie die laat zien dat IL-6 mRNA productie verlaagd was in C/EBPδ deficiënte muizen in vergelijking met wildtype muizen tijdens een Escherichia Coli veroorzaakte buikholteontsteking.3 Ten slotte vonden we ook tijdens nierfibrose, geïnduceerd door afbinden van de ureter, geen rol voor C/EBPδ in de ontstekingsreactie gemeten als macrofaag influx of cytokine productie.

Onze bevinding laten duidelijk zien dat de rol van C/EBPδ in de ontstekingsreactie erg complex en niet zo eenduidig is als op basis van de beschikbare literatuur verwacht kan worden. Een mogelijke verklaring voor de op het eerste gezicht tegenstrijdige resultaten zou kunnen
liggen in het feit dat tijdens bacteriële infecties verschillende signaleringsroutes worden geactiveerd4-6, terwijl eerder beschreven resultaten waarbij C/EBPδ een duidelijke rol speelt in cytokine productie vooral zijn verkregen door de ontstekingsreactie op te wekken met (bacteriële)
componenten (LPS en IgG immuuncomplexen) die een enkele signaleringsroute activeren.1;2;7

Kennis over de rol van C/EBPδ in de ontstekingsreactie verkregen met de studies beschreven in dit proefschrift moeten verder uitgebouwd worden, met de focus op de op het eerste gezicht tegenstrijdige resultaten op cytokine productie. Daarnaast moeten deze resultaten worden
geïntegreerd met de resultaten van de verschillende studies die elders beschreven zijn, om zo een beter begrip van de exacte rol van C/EBPδ tijdens de ontstekingsreactie en infectieziekten te krijgen.
In het tweede deel van dit proefschrift hebben we getracht meer inzicht te krijgen in de rol van protease geactiveerde receptoren (PARs) in fibrose. Verschillende studies hadden al laten zien dat
– 6 –
PARs een sleutelrol spelen tijdens de fibrotische response in verschillende organen. Inderdaad, genetische verwijdering van PAR-1 beperkt de vorming van littekenweefsel in de long8 en lever9, terwijl PAR-2 deficiëntie beschermt tegen de vorming van littekenweefsel in long10, lever11 en nier.12 De resultaten beschreven in dit proefschrift laten zien dat PAR-1 en PAR-2 beide bijdragen aan de fibrotische response in de huid en dat de rol van deze receptoren in fibrose mogelijk meer een algemeen mechanisme, dan een orgaan specifiek mechanisme is. Verder laten
we zien dat het farmacologisch remmen van PAR-1 beschermd tegen het ontstaan van longfibrose, zelfs als het in een later stadium van het experiment werd toegediend als de fibrotische response al in een vergevorderd stadium was. Dit is bijzonder interessant omdat dit
mogelijkheden biedt patiënten met longfibrose te behandelen voor wie op dit moment geen effectieve medicijnen/therapieën beschikbaar zijn. Voordat het remmen van PAR-1 als standaardbehandeling kan worden geïmplementeerd is echter meer onderzoek nodig omdat de
resultaten hier beschreven zijn verkregen in experimentele muismodellen.
Ondanks dat er een mogelijke rol voor PAR-4 in longfibrose is gesuggereerd in de literatuur13;14, lijkt PAR-4 geen belangrijke rol te spelen in de fibrotische response in de long. Of dit ook geldt voor de fibrotische response in andere organen blijft onbekend, maar de bijdrage
van PAR-4 in de fibrotische respons is zeker geen algemeen geldend mechanisme.

References
1. Slofstra, S. H., A. P. Groot, M. H. Obdeijn, P. H. Reitsma, H. ten Cate, and C. A. Spek.
2007. Gene expression profiling identifies C/EBPdelta as a candidate regulator of
endotoxin-induced disseminated intravascular coagulation. Am J Respir Crit Care Med
176:602-609.
2. Yan, C., P. F. Johnson, H. Tang, Y. Ye, M. Wu, and H. Gao. 2012. CCAAT/Enhancer-
Binding Protein delta Is a Critical Mediator of Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung
Injury. Am J Pathol. 182:420-430.
3. Litvak, V., S. A. Ramsey, A. G. Rust, D. E. Zak, K. A. Kennedy, A. E. Lampano, M.
Nykter, I. Shmulevich, and A. Aderem. 2009. Function of C/EBPdelta in a regulatory
circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat
Immunol 10:437-443.
4. Balamayooran, T., G. Balamayooran, and S. Jeyaseelan. 2010. Toll-like receptors and
NOD-like receptors in pulmonary antibacterial immunity. Innate Immun 16:201-210.
5. Kovach, M. A. and T. J. Standiford. 2011. Toll like receptors in diseases of the lung. Int
Immunopharmacol 11:1399-1406.
6. Opitz, B., V. van Laak, J. Eitel, and N. Suttorp. 2010. Innate Immune Recognition in
Infectious and Noninfectious Diseases of the Lung. Am J Respir Crit Care Med
181:1294-1309.
– 8 –
7. Yan, C., M. Zhu, J. Staiger, P. F. Johnson, and H. Gao. 2012. C5a-regulated
CCAAT/Enhancer-binding Proteins beta and delta Are Essential in Fc gamma Receptormediated
Inflammatory Cytokine and Chemokine Production in Macrophages. J Biol
Chem 287:3217-3230.
8. Howell, D. C. J., R. H. Johns, J. A. Lasky, B. Shan, C. J. Scotton, G. J. Laurent, and R.
C. Chambers. 2005. Absence of proteinase-activated receptor-1 signaling affords
protection from bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Am J Pathol
166:1353-1365.
9. Rullier, A., J. Gillibert-Duplantier, P. Costet, G. Cubel, V. Haurie, C. Petibois, D. Taras,
N. Dugot-Senant, G. Deleris, P. Bioulac-Sage, et al. 2008. Protease-activated receptor 1
knockout reduces experimentally induced liver fibrosis. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 294:G226-G235.
10. Borensztajn, K., P. Bresser, C. van der Loos, I. Bot, B. van den Blink, M. A. den
Bakker, J. Daalhuisen, A. P. Groot, M. P. Peppelenbosch, J. H. von der Thusen, et al.
2010. Protease-Activated Receptor-2 Induces Myofibroblast Differentiation and Tissue
Factor Up-Regulation during Bleomycin-Induced Lung Injury Potential Role in
Pulmonary Fibrosis. Am J Pathol 177:2753-2764.
11. Knight, V., J. Tchongue, D. Lourensz, P. Tipping, and W. Sievert. 2012. Proteaseactivated
receptor 2 promotes experimental liver fibrosis in mice and activates human
hepatic stellate cells. Hepatology 55:879-887.
– 9 –
12. Chung, H., M. D. Hollenberg, and D. A. Muruve. 2013. Proteinase-activated receptor-2
transactivation of EGF- and TGFbeta-receptor signaling pathways contributes to renal
fibrosis. J Biol Chem.
13. Peters, T. and P. J. Henry. 2009. Protease-activated receptors and prostaglandins in
inflammatory lung disease. Br J Pharmacol 158:1017-1033.
14. Ramachandran, R., F. Noorbakhsh, K. DeFea, and M. D. Hollenberg. 2012. Targeting
proteinase-activated receptors: therapeutic potential and challenges. Nat Rev Drug
Discov 11:69-86.

print