Auteur: Judith E. Glim

Promotiejaar: 2014

Samenvatting: Voorkant Proefschrift JE Glim

Wereldwijd lijden veel mensen aan de gevolgen van incorrecte genezing, resulterend in chronische wonden of juist fibrotische littekens. In chronische wonden lijkt het genezingsproces te blijven steken, terwijl het proces overactief is in fibrotische littekens. Fibrotische ofwel hypertrofische littekens zijn meestal het gevolg van brand- of diepe wonden en worden gekenmerkt doordat ze stug, verheven en rood zijn, jeuken en samentrekkende eigenschappen vertonen. Deze littekens zijn erg hinderlijk voor patiënten doordat ze pijn en een verminderde mobiliteit teweeg kunnen brengen wat kan leiden tot functionele en psychische problemen.

Littekens zijn vaak het gevolg van verwonding aan de huid. Interessant genoeg zien we dat wonden in de orale mucosa anders genezen dan huidwonden. Orale wonden genezen zeer snel en littekenvorming wordt vrijwel niet waargenomen. Daarnaast wordt fibrose niet gezien tijdens orale genezing, in tegenstelling tot dermale wonden. Helaas is het exacte mechanisme dat verantwoordelijk is voor littekenloze genezing nog niet achterhaald. In dit proefschrift hebben wij geprobeerd om nog meer inzicht te krijgen in de verschillen tussen orale en dermale wondgenezing. Het uiteindelijke doel is om het genezingsproces dusdanig te beïnvloeden zodat littekenvorming beperkt zal worden.

Een van de immuuncellen die uitbundig bestudeerd is tijdens genezing is de macrofaag. Macrofagen kunnen veel verschillende fenotypes aannemen en de best geformuleerde fenotypen zijn de klassiek (M1) en alternatief (M2) geactiveerde macrofagen. M1 macrofagen zijn betrokken bij pro-inflammatoire en M2 macrofagen bij anti-inflammatoire reacties. Macrofagen spelen een belangrijke rol tijdens genezing aangezien macrofaagdepletie zorgde voor een vertraagde reepithelialisatie en vascularisatie, verminderde collageen depositie en vertraagde wondcontractie. Het is beschreven dat M1 macrofagen in grote mate aanwezig zijn in chronische wonden, terwijl M2 macrofagen geassocieerd zijn met fibrose. Helaas zijn er op dit moment geen duidelijk typerende markers voor M1 en M2 macrofagen. Wij hebben een aantal markers getest en kwamen tot de conclusie dat de markers CD40 en CD64 het beste gebruikt kunnen worden voor M1, en CD206 en CD163 voor M2 macrofaag identificatie.

Vervolgens hebben wij gekeken naar het effect van M1 en M2 macrofagen op fibroblasten. De fibroblasten, ofwel steuncellen genoemd, vermeerderen tijdens de wondgenezing en onder invloed van factoren als transforming growth factor (TGF)-β differentiëren enkele cellen tot myofibroblasten, welke α-smooth muscle actin (SMA) tot expressie brengen. Deze myofibroblasten produceren grote hoeveelheden bindweefsel en zijn verantwoordelijk voor wondcontractie. Tijdens de remodelleringsfase gaan deze cellen in apoptose. In fibrotische weefsels gebeurt dit echter niet en blijven de myofibroblasten in grote getallen aanwezig. Aangezien M2 macrofagen geassocieerd zijn met fibrose is de relatie met myofibroblasten onderzocht. Dit om na te gaan of M2 macrofagen een rol spelen in littekenvorming zoals gevonden wordt in dermale maar niet in orale wonden. Wij hebben ontdekt dat α-SMA in fibroblasten geïnduceerd wordt door M2 maar niet door M1 macrofagen. Dit effect werd gezien in zowel dermale als orale fibroblasten. Als eerste werd gedacht dat deze opregulatie veroorzaakt werd door TGF-β. Verder onderzoek toonde aan dat dit niet het geval was, maar dat platelet derived growth factor (PDGF)-CC, wat geproduceerd wordt door M2 macrofagen, verantwoordelijk was voor α-SMA inductie in fibroblasten.

Aansluitend daarop hebben we gekeken naar de aanwezigheid van deze macrofagen en andere immuuncellen in dermale en orale littekens. Gezonde orale mucosa bevatte minder neutrofielen, macrofagen en M2 macrofagen, maar bevatte weer meer bloedvaten dan huid. Tussen beide littekens was echter geen verschil te zien in het aantal immuuncellen.

De meeste studies die wondgenezing bestuderen maken gebruik van diermodellen. Vanwege de verschillen tussen mens en dier kunnen deze resultaten niet altijd vertaald worden naar de humane situatie. Om de humane genezing in vivo na te bootsen hebben wij een muismodel ontwikkeld. De muizen die gebruikt zijn in dit model zijn zeer immuundeficiënt waardoor verwacht werd dat xenotransplantaten niet afgestoten zullen worden. Na 90 dagen was het transplantaat ingegroeid, hoewel de meeste transplantaten een korst bevatten. Bij een van de transplantaten was de korst reeds afgevallen en was het transplantaat behoorlijk gekrompen. Door deze bevindingen is het model nog niet geschikt om wondgenezing in te onderzoeken. Om uiteindelijk toch bruikbaar te zijn, is het raadzaam om parameters zoals transplantatiedikte en -grootte aan te passen in het model.

Vanwege ethische redenen is het noodzakelijk om gebruik te maken van alternatieven voor proefdieren waarin de humane wondgenezing bestudeerd kan worden. Wij hebben het effect van macrofagen onderzocht tijdens humane ex vivo wondgenezing. In ex vivo humane huid werd een wond aangebracht en om de vier dagen werden M1 en M2 macrofagen toegevoegd. We ontdekten dat M2 macrofagen in staat zijn om de wond sneller te sluiten dan M1 macrofagen. Ook migreerden meer fibroblasten uit de huid onder invloed van M2 macrofagen. Op mRNA niveau kwam PLOD2, een gen betrokken bij collageen crosslinking en geassocieerd met fibrose, verhoogd tot expressie in wonden die behandeld waren met M2 macrofagen. Dit impliceert dat M2 macrofagen gerelateerd zijn aan fibrose.

Als laatste hebben wij gekeken naar bindweefsel componenten die mogelijk verschillen tussen huid en orale mucosa. Littekenloze of vormende genezing kan mogelijk beïnvloed kan worden door de samenstelling van deze componenten. Fibronectine, fibronectine ED-A en chondroitine sulfaat waren meer aanwezig in orale mucosa, terwijl elastine voornamelijk in huid voorkwam. Daarnaast bevatte de orale mucosa meer bloedvaten, vertoonden orale keratinocyten meer proliferatie, terwijl dermale keratinocyten verder gedifferentieerd waren.

Tot slot concluderen wij dat snelle immuun reacties belangrijk zijn voor effectieve genezing. M2 macrofagen zorgen voor snelle wondsluiting, maar langdurige aanwezigheid van deze cellen kan leiden tot overmatige of hypertrofische littekenvorming. Een juiste balans tussen M1 en M2 macrofagen is dus essentieel om de genezing zo voorspoedig mogelijk te laten verlopen. Omgevingsfactoren zoals bindweefsel componenten kunnen verantwoordelijk zijn voor het handhaven van de juiste balans tussen M1 en M2 macrofagen tijdens het genezingsproces.

print