Auteur: H. Monsuur

Promotiejaar: 2018

De huid is ons grootste orgaan en vormt een belangrijke barrière tegen ziekteverwekkers, uv-straling en chemische stoffen. Ook houdt de huid vochtverlies van ons lichaam tegen. Grondige kennis van de opbouw en functie van gezonde huid is vereist om ziektebeelden van de huid te begrijpen. Die kennis is ook van belang voor de ontwikkeling van geavanceerde therapieën om brandwonden te genezen.

De huid is opgebouwd uit drie lagen; de epidermis, de dermis en het onderhuids vetweefsel. De epidermis vormt de buitenste laag van de huid en wordt gevormd door ongeveer zes tot tien

cellagen keratinocyten, waarvan de diepste laag de delende cellen bevat en de buitenste laag de cellen die geen celkern meer hebben en uiteindelijk van de huid zullen afslijten. De dermis is de tweede laag van de huid. Deze bestaat voornamelijk uit extracellulaire matrixeiwitten, zoals collageen en elastine. Deze eiwitten worden gemaakt door de fibroblasten. De dermis bevat bloedvaten die zuurstof en voedingsstoffen aanleveren en afvalstoffen verwijderen. Daarnaast is de bloedsomloop ook de belangrijkste route voor de aanvoer van immuuncellen, bijvoorbeeld tijdens een ontsteking. Verder zijn er lymfevaten, haarzakjes, talgklieren, zweetklieren en zenuwen te vinden in de dermis. Het onderhuidse vetweefsel bestaat grotendeels uit vetcellen en extracellulaire matrixeiwitten. Deze matrix wordt gemaakt door de stromale cellen uit het vetweefsel. Ook zijn er bloedvaten, lymfevaten, haarzakjes en zenuwen aanwezig.

 

Wanneer de huid verwond is tot in de dermis zal er altijd een litteken ontstaan. Dit litteken kan bijna onzichtbaar zijn, maar het kan ook een verdikt (hypertrofisch) litteken zijn. Dat deze littekens verdikt zijn, komt door overtollig aanleg van matrixeiwitten, ook wel fibrose genoemd. Hypertrofische littekens ontstaan vooral na derdegraads brandwonden, maar ook regelmatig na een chirurgische incisie. De patiënten met hypertrofische littekens hebben vaak last van jeuk, pijn, contracturen en veranderingen in de thermoregulatie van de huid. Hypertrofische littekens kunnen ook leiden tot psychische problemen.

Tot op heden lag de focus van onderzoeken op de rol van keratinocyten en fibroblasten in het ontstaan van hypertrofische littekens. Er zijn echter nog andere celtypes in de huid en in het onderhuids vetweefsel die mogelijk een rol spelen in wondgenezing en littekenvorming. Zo is het beschreven dat hypertrofische littekens meer bloedvaatjes bevatten dan normale littekens. Het is nog onduidelijk of de endotheelcellen, die de bloedvaatjes vormen, daadwerkelijk bijdragen aan het ontstaan van hypertrofische littekens of niet. Daarom hebben we in dit onderzoek gekeken naar de rol van endotheelcellen in het ontstaan van hypertrofische littekens.

Ook voor het ontwikkelen van geavanceerde therapieën op basis van tissue engineering (kweken van weefsel) is het belangrijk om de functies van cellen en weefsels goed te begrijpen. Omdat er niet altijd voldoende huid beschikbaar is om cellen uit te isoleren voor tissue engineering is het vetweefsel mogelijk een goede, alternatieve bron van cellen. Zo zouden vetweefselendotheelcellen gebruikt kunnen worden in tissue engineering om ervoor te zorgen dat er sneller bloedvaten het weefsel ingroeien. In eerder onderzoek is echter bevonden dat stromale cellen uit het vetweefsel, in tegenstelling tot dermale fibroblasten, bijdragen aan een hypertrofisch fenotype in een huidmodel. Dit betekent dat twee vergelijkbare celtypes afkomstig van twee verschillende weefsels dus niet altijd allebei geschikt zijn voor gebruik in tissue engineering.

 

Voor dit proefschrift hebben we de volgende vragen onderzocht:

1) Spelen endotheelcellen een rol in de ontwikkeling van een hypertrofisch litteken?

2) Kan het vetweefsel gebruikt worden als alternatieve bron van endotheelcellen voor tissue

engineering?

 

In vitro- en computermodellen voor het bestuderen van celgedrag in de huid

 

Verschillende in vitro-modellen zijn toegepast om de onderzoeksvragen te beantwoorden. In

hoofdstuk 2 wordt een aantal van deze modellen beschreven dat gebruikt is om mobiliteit van cellen te bestuderen. Zo is er een zogenoemd scratch assay gebruikt waarbij een gedeelte van een enkele, volle laag cellen wordt weggekrast waardoor een open ruimte ontstaat. Met dit assay is de migratie van fibroblasten en endotheelcellen bestudeerd. Daarbij werd bevonden dat fibroblasten als losse cellen migreren, terwijl endotheelcellen als groep migreren. Dit past ook bij de in vivo-situatie waar fibroblasten als losse cellen in het weefsel zitten, terwijl endotheelcellen cel-celcontact nodig hebben om zo bloedvaten te vormen. Tijdens wondgenezing spruiten er nieuwe bloedvaatjes uit de reeds bestaande vaten. Dit proces noemen we angiogenese. De eerste fase van angiogenese noemen we sprouting (uitspruiten). In het sprouting assay wordt een laag endotheelcellen uitgezaaid op een fibrinematrix, waarna enkele van deze cellen sprouts vormen in de matrix wanneer ze zijn blootgesteld aan vaatvormende factoren zoals bFGF en VEGF. Voor het vormen van nieuwe bloedvaten zijn naast migratie ook celdeling en matrixafbraak nodig, waardoor dit assay complexer is dan een scratch assay. Om te bestuderen hoe keratinocyten en melanocyten over een matrix migreren en hoe fibroblasten een matrix in migreren is een huidsubstituut, dat was ontwikkeld voor het behandelen van chronische wonden, gebruikt als model. Hiermee werd bevonden dat melanocyten langzamer migreren dan keratinocyten en dat bij aanwezigheid van keratinocyten de fibroblasten verder omhoog de dermis in migreren dan wanneer deze afwezig zijn. De modellen die in hoofdstuk 2 zijn beschreven variëren van modellen met één enkele celtype tot meer ingewikkelde weefselmodellen met meerdere celtypes. Met behulp van dit soort modellen bestuderen wij de rol van endotheelcellen in het ontstaan van hypertrofische littekens en kunnen we bepalen of de endotheelcellen uit het vetweefsel geschikt zijn voor tissue engineering.

In hoofdstuk 3 is een wiskundig model beschreven dat ontwikkeld is om het sprouting assay na te bootsen. In dit wiskundig model worden de cellen als individuele componenten behandeld en wordt er rekening gehouden met de twee endotheel fenotypes; leidende en volgende cellen. Onze studie heeft laten zien dat met een wiskundig model een biologisch proces nagebootst kan worden, waarbij de resultaten, verkregen met dit model, vergeleken zijn met de resultaten van het celkweekmodel. In de toekomst zou een wiskundig model kunnen helpen bij het voorspellen hoe een nieuw middel angiogenese beïnvloedt op een zeer gestandaardiseerde, gecontroleerde manier.

Het huidsubstituut dat in hoofdstuk 2 als model is beschreven, is eerder gebruikt in een klinische studie voor de behandeling van chronische wonden. Aangezien angiogenese belangrijk is voor het sluiten van chronische wonden hebben we in hoofdstuk 5 gekeken of dit huidsubstituut angiogenese stimuleert. Hiervoor zijn drie versies van dit substituut gemaakt, één met alleen fibroblasten, één met alleen keratinocyten en één met beide celtypes. Het effect van deze substituten op endotheelceldeling, migratie en sprouting is bekeken, waarbij werd bevonden dat het substituut met beide celtypes het best deze processen stimuleerde en dat dit voornamelijk via VEGF gebeurde. Een substituut met zowel keratinocyten (epidermis) als fibroblasten (dermis) stimuleert angiogenese het sterkst, wat in de kliniek zal bijdragen aan het genezingsproces van chronische wonden. Voor de genezing van brandwonden of andere acute wonden is het beter om een minder sterk stimulerend substituut te gebruiken, omdat een volledig huidsubstituut mogelijk ook het ontstaan van hypertrofische littekens stimuleert. Echter, een minder stimulerend substituut zal tijdens de behandeling van brandwonden en acute wonden ook minder ingroei van nieuwe bloedvaatjes in het substituut stimuleren, terwijl dit juist zo nodig is voor goede doorbloeding. Verder onderzoek moet uitwijzen of het toevoegen van endotheelcellen aan het substituut ervoor kan zorgen dat wel snel vaatjes ingroeien, maar er geen hypertrofische littekens ontstaan.

 

Spelen endotheelcellen een rol in de ontwikkeling van een hypertrofisch litteken?

 

Hypertrofische (fibrotische) littekens ontstaan voornamelijk na diepe wonden waarbij het vetweefsel bloot ligt, terwijl ondiepe wonden meestal niet leiden tot hypertrofische littekens. Het is nu algemeen geaccepteerd dat de stromale cellen uit het vetweefsel een bijdrage leveren aan het ontstaan van hypertrofische littekens en dat deze cellen anders functioneren dan dermale fibroblasten. Het is echter nog onbekend of de endotheelcellen uit het vetweefsel of dermis ook van elkaar verschillen.

De resultaten in hoofdstuk 4 laten zien dat er geen verschil is tussen beiden celtypes in oppervlaktereceptoren en dat er minimale verschillen zijn in celdeling, sproutvorming en uitscheiding van inflammatoire en angiogenese eiwitten. De resultaten wijzen uit dat de

vetweefsel- en dermale-endotheelcellen dezelfde karakteristieken hebben. Dit in tegenstelling tot vetweefsel stromale en dermale fibroblasten. Op basis van deze bevindingen is het niet aannemelijk dat vetweefsel-endotheelcellen direct bijdragen aan het ontstaan van hypertrofische littekens. Het is wel mogelijk dat ze hier indirect aan bijdragen wanneer ze beïnvloed worden door factoren die aanwezig zijn in een wondbed of via interacties met andere celtypes in de wond. Dit hebben we onderzocht in hoofdstuk 6 en 7.

In hoofdstuk 6 is het wondbed nagebootst door dermale- en vetweefsel-endotheelcellen, dermale fibroblasten en vetweefsel stromale cellen bloot te stellen aan brandwondextract (BWE) verkregen van derdegraadsbrandwonden. De genezing van brandwonden verschilt op allerlei punten van genezing van snijwonden. Zo voorkomt de aanwezigheid van de dode huid (eschar) op de brandwond het ontstaan van granulatieweefsel. Dit granulatieweefsel is essentieel voor wondgenezing. Echter, zodra de dode huid verwijderd is, wordt er een buitensporige hoeveelheid granulatieweefsel gevormd wat er voor kan zorgen dat er een hypertrofisch litteken ontstaat. In hoofdstuk 6 werd bevonden dat BWE endotheelcelmigratie en uitscheiding van inflammatoire eiwitten stimuleert, terwijl celdeling en sprouting niet beïnvloed worden. Wanneer celdeling of sprouting werd gestimuleerd door bFGF werd dit positieve effect geremd zodra er ook BWE aanwezig was. Aan de andere kant werden zowel celdeling als migratie van dermale fibroblasten en vetweefsel stromale cellen gestimuleerd door BWE. Als in de praktijk de aanwezigheid van dode huid inderdaad endotheelceldeling en sprouting remt, zou dit verklaren waarom de aanmaak van buitensporig veel granulatieweefsel pas begint nadat de dode huid verwijderd is. In de toekomst kan uitgezocht worden welke remmende factoren aanwezig zijn in BWE en of deze als therapie ingezet kunnen worden na het verwijderen van de dode huid om buitensporig granulatieweefsel en littekenvorming te voorkomen. Ook dit hoofdstuk laat geen verschillen tussen vetweefsel- en dermale endotheelcellen zien, wat nogmaals suggereert dat de vetweefsel-endotheelcellen niet direct bijdragen aan het ontstaan van hypertrofische littekens.

In hoofdstuk 7 is een huidmodel gebruikt waarmee cel-celinteracties bestudeerd kunnen

worden tussen dermale- of vetweefsel-endotheelcellen enerzijds en dermale fibroblasten of vetweefsel stromale cellen anderzijds. Huidmodellen met dermale fibroblasten samen met dermale- of vetweefsel-endotheelcellen lieten een normale huid fenotype zien. Daarentegen laten huidmodellen met vetweefsel stromale cellen samen met dermale- of vetweefsel- endotheelcellen een fibrotisch fenotype zien. Dit fibrotische fenotype kenmerkte zich door het samentrekken van de matrix, hogere genexpressie van pro-fibrotische genen (ACTA2, COL1, COL3) en minder uitscheiding van het anti-fibrotische eiwit follistatin. Ook hier werd geen verschil ontdekt tussen de dermale- en vetweefsel-endotheelcellen. Het onderliggende moleculaire mechanisme is bestudeerd door de ALK4/5/7-receptoren van de pro-fibrotische TGF-β-superfamilie te blokkeren of door het anti-fibrotische eiwit follistatin toe te voegen. Het samentrekken van de matrix kon voor een groot gedeelte voorkomen worden door de ALK4/5/7-receptoren te blokkeren en in mindere mate ook door het toevoegen van follistatin. Hoofdstuk 7 laat zien dat endotheelcellen, afkomstig van dermis of vetweefsel, samen met vetweefsel stromale cellen voor een fibrotisch huidmodel zorgen.

 

Kan het vetweefsel gebruikt worden als alternatieve bron van endotheelcellen voor tissue engineering?

 

Om ervoor te zorgen dat het lichaam huidsubstituten accepteert, bijvoorbeeld voor behandeling van derdegraadsbrandwonden of chronische wonden, is het belangrijk dat er snel ingroei van bloedvaten komt. Om ingroei van bloedvaten te versnellen, kan ervoor gekozen worden om endotheelcellen toe te voegen aan het substituut. In tissue engineering wordt steeds vaker gekozen om endotheelcellen uit het vetweefsel te gebruiken, ook al zijn de eigenschappen van deze endotheelcellen nog niet goed onderzocht.

De resultaten in dit proefschrift laten zien dat dermale- en vetweefsel-endotheelcellen

hetzelfde zijn wat betreft oppervlaktemarkers, celdeling, migratie en sprouting. Dit suggereert dat vetweefsel-endotheelcellen, net als dermale-endotheelcellen, geschikt zijn voor tissue engineering. Het vetweefsel blijkt een zeer geschikte bron van endotheelcellen te zijn, aangezien er voldoende weefsel is en de cellen makkelijk te isoleren zijn. Wel moet er rekening gehouden worden met welke cellen de endotheelcellen een interactie aangaan. Zo laten andere resultaten in dit proefschrift zien dat endotheelcellen in interactie met vetweefsel stromale cellen ervoor zorgen dat het huidmodel een fibrotisch fenotype krijgt, terwijl dit niet gebeurt wanneer endotheelcellen gecombineerd worden met dermale fibroblasten. Bij het maken van huidsubstituten is het dan ook van belang om geen endotheelcellen met vetweefsel stromale cellen te combineren, maar met dermale fibroblasten. Hier moet ook rekening mee gehouden worden wanneer een huidsubstituut met endotheelcellen op een diepe wond wordt aangebracht, aangezien hier het vetweefsel blootligt.

 

Kort samengevat is in dit proefschrift aangetoond dat vetweefsel-endotheelcellen geschikt zijn om te gebruiken in huidsubstituten zolang ze met dermale fibroblasten gecombineerd worden en niet met vetweefsel stromale cellen. Het moet nog wel verder onderzocht worden welk onderliggend moleculaire mechanisme in ons model voor een fibrotisch fenotype zorgt en hoe dit gerelateerd is aan het ontstaan van hypertrofische littekens bij patiënten. In de toekomst kan er een huid-op-een-chipmodel gebruikt worden waarin immuuncellen door kanaaltjes bekleed met endotheelcellen kunnen stromen. Op deze manier kunnen er meer verschillende cel-celinteracties bestudeerd worden en zal ons huidmodel meer lijken op de werkelijke situatie.

print