Afgerond in 2010
Projectduur: 1 jaar pilotstudie
Projectleider: R.H.J. Beelen/ Marjolein van Egmond – VUmc
Achtergrond
Overmatige littekenvorming in de huid na trauma of brandverwonding is een groot klinisch probleem. Het kan leiden tot ernstige functionele en cosmetische klachten. Ontstekingscellen, en met name macrofagen, spelen een belangrijke rol bij het ontstaan van littekenhypertrofie. Zij zijn in staat een milieu te creëren dat fibroblasten kan stimuleren tot overmatige collageenvorming, hetgeen een hypertrofisch litteken tot gevolg kan hebben. Hoe deze beïnvloeding precies geschiedt, is tot heden onbekend.
Doelstelling
In deze studie wordt onderzocht welk effect het extracellulaire milieu van brandwonden heeft op het fenotype van macrofagen (M1/M2) relevant voor de klinische situatie. Het effect hiervan op fibroblastdifferentiatie zal ook worden bestudeerd.
Methoden
De activatie van macrofagen in het milieu van brandwonden en littekens zal worden onderzocht. Supernatant van gereseceerd weefsel van brandwondpatiënten en controle patiënten zal aan monocyten worden toegevoegd. Eschar van brandwonden, geresecteerde littekens, en normale huid zal worden aangeleverd door de afdeling Plastische Chirurgie en Brandwondencentrum van het Rode Kruis Ziekenhuis Beverwijk en de afdeling Plastische Chirurgie van het VU medisch centrum. Direct na afname, wordt het weefsel geïncubeerd in kweekmedium bij 37ºC gedurende 24 uur, waarbij een klein deel wordt verwerkt voor histologie/immunocytochemie. Vervolgens wordt supernatant van dit mengsel bij monocyten gedaan voor 48 uur en het effect worden gemeten op cytokine productie en andere parameters (die het M1/M2 macrofaag fenotype definiëren). Ook wordt het effect van dit macrofagen supernatant op fibroblast differentiatie onderzocht.
Beknopte samenvatting van de resultaten
Dat macrofen een rol spelen bij littekenhypertrofie is glashelder geworden uit de literatuur en ons pilotonderzoek (Mahdavian Delavary et al. Macrophages in skin injury and repair. Immu nobiol 2010, in press). Uit deze review is helder gebleken dat in de verschillende fases van wondheling de diversiteit in het macrofagen fenotype de cruciale factor is.
In ons daadwerkelijke pilotonderzoek zijn via klassieke methodieken M1 en M2 macrofagen gemaakt In deze opzet zijn eerst bloed monocyten geïsoleerd en 5 dagen uitgekweekt tot macrofagen. Vervolgens zijn de macrofagen via kweek in aanwezigheid cytokinen (IFN-gamma + LPS resp. IL4) in 3 dagen uitgedifferentieerd/geactiveerd tot M1 respectievelijk M2. Hierbij werd als echte marker voor M2 de mannose-receptor (MR = CD206) bevestigd als betrouwbare marker (komt in aanzienlijk mindere mate voor op M1, zie figuur 1 in aparte bijlage Figuren!!!!). In de literatuur waren wat eerste berichten over CD40 als mogelijke M1 marker. Deze nu werd door ons geïdentificeerd op de door ons gegenereerde M1 macrofagen, en komt lager tot expressie op M2 macrofagen (Fig. 1). In figuur 1 is het gemiddelde uitgezet van 3 experimenten, allen met dezelfde typering. Met deze zuivere populaties werden vervolgens functionele proeven uitgevoerd, dat wil zeggen het supernatant van M1 resp. M2 werd 3 dagen geïncubeerd met huidfibroblasten, waarbij M2 myofibroblast transformatie lijkt te bevorderen en M1 niet (Fig. 2 gemiddelde van 3 experimenten; paper in progress). Als positieve controle werd TGFB meegenomen die (als mocht worden verwacht) hetzelfde beeld gaf als M2. Nu deze markers zijn geïdentificeerd zullen wij het panel loslaten aan cytokines op zuivere M1 en M2 en vervolgens volgens plan de verzamelde monsters indelen en functioneel uittesten (zie 3.21). Op voorhand konden wij aantonen dat IL-12 met name wordt geproduceerd door M1 en in het geheel niet door M2. Resumerend uit dit deel is glashelder geworden dat wij goede markers hebben voor M1 resp. M2 en dat deze ook functioneel verschillend zijn, waarbij onze hypothese is bevestigd dat M2 myofibroblastformatie induceert. Interessant genoeg hebben wij tevens preliminair aangetoond dat gingivafibroblasten niet tot myobroblasten worden aangezet door M2, wat een mogelijke verklaring kan zijn van littekenloze heling in de orale mucosa.
Betreffende het vooronderzoek klinisch materiaal is controle materiaal verzameld, eschar is verzameld en littekenweefsel (van normotroof tot hypertroof). M.t. de cytokinen waren MDC, IL1RA, IL-10, IL-12 (40), IL-12 (70) en IL-1B het meest bruikbaar. Er werden hierbij verschillen gevonden tussen de 4 groepen waarbij ILRA1 overheerst in eschar (hypertroof). MDC een M2 cytokine is hoog in hypertroof versus normotroof (zie figuur 5 van alle groepen en uitvergroting hepertroof/normotroof in figuur 6). Deze figuren zijn het gemiddelde van 6-9 monsters per groep. Tenslotte is opnieuw IL-12 (zie figuur 5 en 6) sterk verhoogd in normotroof versus hypertroof (en eschar), hetgeen er op wijst dat inderdaad meer M1-achtige cytokines worden geproduceerd in normotrofe littekens. Verassend genoeg is IL-10 niet erg verschillend in de groepen, wat er op kan wijzen dat Il-10 toch een minder betrouwbaar cytokine is voor de indeling M1/M2 als beschreven. Dit is nog verder in studie, alsmede PCR van het materiaal PCR wijst preliminair op toename IL-4, IL13 en IL23 in hypertrofo versus normotroof, wat de hypothese lijkt te bevestigen dat hier M2 macrofagen het dominerende type is (paper in progress).
Ten slotte werd als uitbreiding de immuungecomprimiteerde NOG opgezet, waarin wij humane huid hebben getransplanteerd. Dit is voorshands gelukt en vervolgens zullen we nu het effect van humane macrofaagsubpopulaties op de (hypertrofe) wondheling in vivo gaan bestuderen, alles lopend in het NWO mozaïek project wat uit de huidige pilot is voortgekomen. Aan het eind van dit project zullen we exact de balans in kaart hebben, de rol van het macrofaagfenotype in deze en dus in littekenhypertrofie. We zullen tijdens dit project ook identificeren hoe deze balans ten gunste van normotrofe littekenvorming is te verschuiven en verwachten aan het eind van dit project een klinische studie te starten waarvoor we preluderen over 2-3 jaar een aanvraag bij NBS in te dienen.