Auteur: A. El Ghalbzouri
Promotiejaar 2004
ISBN-10: 90-74013-06-6
Samenvatting
Artificiële huidmodellen zijn momenteel van zodanig goede kwaliteit dat zij grote gelijkenis vertonen met de natieve humane huid en vormen daardoor een veelbelovend alternatief voor de vermindering en wellicht vervanging van proefdieren in toxicologisch onderzoek en als een product om huiddefecten te bedekken. Gereconstrueerde huidequivalenten zijn driedimensionale modellen die vervaardigd worden door 1 week gekweekte dermale matrices (bestaande uit collageen geïsoleerd uit rattenstaarten) die meestal fibroblasten bevatten te bezaaien met keratinocyten. Hierna wordt het model geheel blootgesteld aan de lucht, waardoor de keratinocyten verder kunnen prolifereren en differentiëren totdat er een epidermis wordt gevormd die grote gelijkenissen vertoont met de normale huid. In hoofdstuk 1 is een overzicht gegeven van de opbouw en structuur van de huid en de basisrichtlijnen die nodig zijn voor het opzetten van driedimensionale huidequivalenten. Voorafgaande studies naar b.v. wondgenezing, huidveroudering, immunologische en moleculaire biologische processen werden verricht met huidmodellen die belangrijke eigenschappen misten, zoals de expressie van specifieke differentiatie en proliferatie eiwitten, de expressie van de “cornified envelope” eiwitten en de aanwezigheid van de fibroblasten in de dermale matrix. Er is relatief weinig bekend over de exacte rol van fibroblasten in verschillende biologische processen die de epidermale proliferatie en differentiatie dirigeren. Het doel van mijn onderzoek was dan ook om de rol van deze fibroblasten op de epidermale morfogenese (vorm en opbouw van de epidermis), wondgenezing en de vorming van de basale membraan (BM) te bestuderen. Daarnaast hebben we ook gekeken of het mogelijk was om deze verbeterde huidmodellen te gebruiken voor therapeutische en diagnostische doeleinden.
Is het mogelijk om het toevoegen van groeifactoren aan de huidmodellen te vervangen door gebruik te maken van fibroblast-bevattende dermale substraten?
Een epidermis die gereconstrueerd is in de afwezigheid van exogene groeifactoren vertoont een zeer slechte morfologie, (hoofdstuk 2, 3 en 4). Daarnaast worden zeer belangrijke basale membraan eiwitten (b.v. laminine 5, collageen type IV en VII) niet aangemaakt waardoor de aanhechting van de epidermis aan de dermale matrix minimaal is (hoofdstuk 4). Om dit te verbeteren is het aan te bevelen om naast EGF (Epidermale Groeifactor) ook andere verschillende groeifactoren (GM-CSF (Granulocyt Monocyt-Kolonie Stimulerende Factor), KGF (Keratinocyten Groeifactor), IGF-I, (Insuline Groeifactor-type I)) toe te voegen aan het medium waarin deze huidmodellen worden gekweekt.
In hoofdstuk 2 hebben we bestudeerd of het toevoegen van deze groeifactoren vervangen kon worden door het incorporeren van humane fibroblasten in de dermale matrix. Om dit te bereiken hebben we huidmodellen vervaardigd waarin geen of verschillende hoeveelheden fibroblasten zijn geïncorporeerd in de dermale matrix. In huidmodellen die geen fibroblasten bevatten werd een epidermis gevormd met 3 tot 4 cellagen, terwijl in huidmodellen met fibroblasten het aantal lagen verdubbelde en de structuuropbouw microscopisch er veel beter uitzag. Het eiwit keratine 10 (K10), karakteristiek voor differentiërende keratinocyten kwam onafhankelijk van de aan- of afwezigheid van de fibroblasten in de dermale matrix, tot expressie in de suprabasale cellagen. De expressie van de eiwitten K6, K16 en K17 (kenmerkend voor hyperproliferatie) was in de huidmodellen zonder fibroblasten veel hoger dan in de huidmodellen met fibroblasten, wat aangeeft dat fibroblasten een belangrijke rol spelen bij de proliferatie en differentiatie van de keratinocyten. Ook de “cornified envelope” eiwitten SKALP (skin-derived antileukoproteinase) en involucrine vertoonden een veel lagere expressie in de huidmodellen die fibroblasten bevatten. Verder werden de BM eiwitten collageen type VII en laminine 5 gesynthetiseerd en was de expressie van het integrine a6b4 en E-cadherine vergelijkbaar met de natieve huid. Deze fibroblast-afhankelijke expressie was veel intenser in huidmodellen waarvan de dermale matrix met fibroblasten voor een langere periode werd gekweekt voordat de keratinocyten erop werden uitgezaaid. Samenvattend kunnen we stellen dat de aanwezigheid van fibroblasten in de dermale matrix een kritische rol speelt bij de vorming en het tot stand brengen van een normale epidermale morfogenese (hoofdstuk 2 en 3). Een soortgelijke studie werd ook gedaan in huidmodellen met dermale matrices vervaardigd met dermis afkomstig van humane kadaverhuid (hoofdstuk 3). Door een nieuwe ontwikkelde centrifugatietechniek waren we nu ook in staat om fibroblas
Hoe belangrijk zijn de fibroblasten in het dirigeren van de epidermale morfogenese en BM vorming in de huid?
In hoofdstuk 4 werd de rol van fibroblasten op de vorming van de BM bestudeerd. Onafhankelijk van de aan- of afwezigheid van fibroblasten, kwam K14 en enkele hemidesmosomale eiwitten (plectine, BP230, BP180, integrines a1b1, a2b1, a3b1 en a6b4) tot expressie terwijl laminine 1 dat niet deed. Alleen in de aanwezigheid van fibroblasten of groeifactoren (EGF, KGF) werden laminine 5, laminine 10 en 11, nidogen, unceïne, type IV en type VII collageen gedetecteerd in de zone tussen de dermale matrix en de basale keratinocyten. Deze resultaten suggereren dat de aanhechting van de epidermis aan de dermale matrix waarschijnlijk wordt gereguleerd door de integrines a1b1 en a2b1 en niet door de laminines, zoals tot nu toe werd aangenomen. Tevens speelt de interactie tussen keratinocyten en fibroblasten een belangrijke rol in de synthese en depositie van verschillende BM eiwitten. Tijdens deze interacties komen er verschillende factoren vrij die een mogelijke rol kunnen spelen in het differentiatie en proliferatie proces van de keratinocyten.
In hoofdstuk 5 hebben we de invloed van de factoren gesynthetiseerd en vervolgens uitgescheiden door fibroblasten, keratinocyten of beide celtypen op de differentiatie, proliferatie en BM vorming nader bestudeerd. Uit deze studie bleek dat de door fibroblasten uitgescheiden factoren in staat waren de epidermale morfogenese en de BM vorming (expressie van lamimine 5 en nidogen) positief te beïnvloeden. Deze effecten werden niet versterkt door de gelijktijdige aanwezigheid van keratinocyten. Uit onderzoek is gebleken dat de uitgescheiden factoren die naast lage concentraties van KGF en GM-CSF ook andere onbekende factoren bevatten die betrokken zouden kunnen zijn bij de vorming van de epidermis en BM. Op basis van een lage expressie van de hyperproliferatie markers K16 en K17 kunnen we concluderen dat factoren uitgescheiden door fibroblasten de normalisatie van epidermale morfogenese kunnen beïnvloeden.
Kunnen huidequivalenten gebruikt worden als model om genetische huidafwijkingen en wondhelingsprocessen te bestuderen?
Hoofdstuk 6 beschrijft het gebruik van het huidequivalent als model voor het bestuderen van de wondgenezing. Tijdens het helen van een wond speelt de migratie en proliferatie van keratinocyten en hun interactie met de fibroblasten en de extracellulaire matrix een essentiële rol. In dit hoofdstuk is voornamelijk gekeken naar de rol van fibroblasten op de wondgenezing en naar de expressie van verschillende eiwitten tijdens de re-epithelisatie van een wond. In de huidequivalenten werden twee verschillende wonden aangebracht, een oppervlakkige wond (verwonding van de epidermis alleen) en een diepe wond (verwonding van zowel de epidermis als het dermale compartiment). De resultaten in deze studie tonen aan dat fibroblasten inderdaad een belangrijke rol spelen bij de re-epithelisatie van de wond en de vorming van de BM. Tevens is gebleken dat laminine 5 veel later tot expressie kwam in de oppervlakkige wond dan in de diepe wond. Deze bevinding kan verklaard worden door te veronderstellen dat tijdens het aanbrengen van een diepe wond, enkele BM eiwitten gehecht blijven aan het dermale oppervlak waardoor er sneller een BM gevormd kan worden. In de niet verwonde huidequivalent, kwam in de migrerende keratinocyten laminine 5, collageen type IV en VII zeer laag tot expressie wat er op wijst dat deze eiwitten waarschijnlijk in vitro geen essentiële rol spelen in dit proces. Verder zagen we dat het re-epithelisatie proces in diepe wonden versnelt werd door de aanwezigheid van KGF en vooral EGF terwijl dat niet het geval was in oppervlakkige wonden. Ten slotte hebben we door gebruik te maken van tweedimensionale gel elektroforese, een eiwit geïdentificeerd (DJ-1) dat verschillend tot expressie kwam tijdens het re-epithelisatie proces. Momenteel is de functie van dit eiwit in de wondgenezingsproces nog niet opgehelderd.
Tijdens de genezing van diepe wonden zullen naast fibroblasten ook andere cellen uit de verwonde omgeving naar het wondgebied migreren en deelnemen aan het genezingsproces. In hoofdstuk 7 hebben we de invloed van dermale fibroblasten en cellen afkomstig van het subcutane vetweefsel op de epidermale morfogenese bestudeerd. Uit deze studie bleek dat in een huidmodel vervaardigd met een dermale matrix, waarin cellen afkomstig van het subcutane vetweefsel aanwezig zijn, een zeer sterke contractie van de dermale matrix optreed. Dit was daarentegen niet het geval met substraten die dermale fibroblasten bevatten. Hoewel er een volledige epidermis gevormd werd in beide huidmodellen, was de expressie van K17 erg hoog en die van collageen type IV erg laag in huidmodellen waarvan de dermale matrix cellen bevatte afkomstig van het subcutane vetweefsel. Ook vonden we in deze huidmodellen dat de keratinocyten een veel lagere migratie snelheid vertoonden en dat de cellen afkomstig van het subcutane vetweefsel zich ophoopten onder de epidermis parallel aan het epidermale compartiment. Soortgelijke bevindingen werden ook waargenomen in humaan littekenweefsel. Hieruit kunnen we concluderen dat het huidmodel ook gebruikt kan worden om in vitro de processen in de wondgenezing en voornamelijk in de littekenvorming beter te bestuderen. In het addendum van dit hoofdstuk (7a) werd onderzocht of deze bovengenoemde verschillen verklaard konden worden door verschillen in eiwitprofielen geproduceerd door deze twee celtypen. Door middel van tweedimensionale gel-elektroforese in combinatie met eiwit massa spectrometrie werd verschil in de expressie van vijf verschillende eiwitten waargenomen. Van deze vijf eiwitten was CRABP-II het meest onderscheidende omdat dit retinoïde bindend eiwit alleen in cellen afkomstig van het subcutane vetweefsel werd gedetecteerd. De exacte functie van dit eiwit in het wondgenezingsproces is nog onduidelijk.
In hoofdstuk 8 werd het gebruik van het huidequivalent als model om genetische huidafwijkingen, zoals b.v. de blaarziekte REBS (recessieve epidermolysis bullosa simplex), nader onderzocht. Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door een acute blaarvorming bij wrijving op de huid. Deze afwijking kan men toeschrijven aan de afwezigheid van keratine tonofilamenten in de keratinocyten door een homozygote mutatie in het K14 gen. De patiënten vertonen een epidermolytische hyperkeratosis (EHK) en een ophoping van tonofilamenten in de suprabasale lagen van de epidermis (dyskeratose). In deze studie werden nondyskeratotische en dyskeratotische huidbiopten van de patiënt en huidbiopten van een patiënt die niet lijdt aan deze ziekte op matrices gebracht die dermale fibroblasten bevatten afkomstig van nondyskeratotische, dyskeratotische en/of gezonde huid. De verkregen resultaten toonden aan dat op basis van de epidermale morfologie de REBS ook in vitro nagebootst kon worden maar niet de EHK. Verder is gebleken dat de fibroblasten een belangrijke regulerende rol hadden in het ontstaan van een REBS fenotype. De resultaten suggereren dan ook dat gezonde fibroblasten de stabiliteit van de aangedane keratinocyten kunnen beïnvloeden. Het onderliggende mechanisme is nog niet opgehelderd.
Zijn we in staat om een huidequivalent te vervaardigen met verschillende celtypen die afkomstig zijn van 1 huidbiopt en waarvan de dermale matrix bio-degradeerbaar is?
Succes van het gebruik van huidequivalenten voor therapeutische doeleinden zou vergroot kunnen worden door incorporatie van een endotheliale netwerk in het dermale compartiment. Hoofdstuk 9 beschrijft het vervaardigen van een huidmodel dat vier verschillende celtypen bevat die afkomstig zijn uit 1 huidbiopt, namelijk keratinocyten, fibroblasten, melanocyten en endotheel cellen. Er werden twee verschillende experimentele benaderingen gebruikt om endotheliale cellen in de matrix te incorporeren; collageen geïsoleerd uit rattenstaarten of collageen gesynthetiseerd door humane fibroblasten. Dit laatste gebeurde door fibroblasten en endotheel cellen aan de onderkant van een filter te zaaien en de keratinocyten en melanocyten aan de bovenkant. Op deze wijze konden de fibroblasten extracellulaire matrix aanmaken waardoor er een huidequivalent werd verkregen met dermale matrix van humane origine. Het endotheliale netwerk in deze matrices vertoonden een driedimensionale structuur, terwijl dat niet het geval was in matrices vervaardigd met rattencollageen. In deze laatst genoemde matrices was de expansie van het endotheliale netwerk alleen in de laterale richting. Deze bevindingen toonden aan dat het type van dermale substraat belangrijk is voor de inductie van de angiogenese. De resultaten beschreven in dit hoofdstuk geven uitzicht op een nieuwe generatie huidequivalenten, bestaande uit meerdere celtypen die gebruikt zouden kunnen worden om huiddefecten te bedekken.
Nu we erin geslaagd waren huidequivalenten te vervaardigen die meerdere celtypen bevatten, hebben we verder onderzocht of het mogelijk is de inerte filter te vervangen door bio-degradeerbare matrices. Dit zou de mogelijke klinische toepassing aanzienlijk vergroten. In hoofdstuk 10 werden verschillende substraten gebruikt om huidequivalenten te produceren (PEGT/PBT, rattencollageen, humane kadaverhuid en fibrine). Uit deze studie bleek dat het gebruik van humane plasmafibrine als dermaal substraat nieuwe perspectieven biedt. Incorporatie van fibroblasten in deze matrix ondersteunde de vorming van een epidermis waarin de keratine eiwitten K6, K16 en K17 zeer laag tot expressie kwamen en de belangrijke BM componenten gesynthetiseerd werden.
In hoofdstuk 11 zijn de bevindingen uit de voorgaande hoofdstukken besproken en verder geïntegreerd in de huidige stand van zaken omtrent de rol van fibroblasten in de regulatie van de epidermale morfogenese.
Summary
The major objective of the thesis was to evaluate the role of fibroblasts in HSEs on epidermal morphogenesis, wound healing and basement membrane formation. In addition, the usefulness of the HSE as a model to study a number of different biological processes, like wound healing, regulation of epidermal proliferation and differentiation and a model for diseased skin has been examined as well. The main issues of this thesis, as defined in the introduction chapter, were to provide answers on the following questions:
- Are fibroblasts present in the dermal compartment capable to replace exogenous growth factor supplementation?
- How important are fibroblasts in controlling epidermal morphogenesis and basement membrane formation in the skin?
- Can we develop a human skin model integrating different skin cell types from a single skin biopsy?
- Can human skin equivalents be used as a model to study genetic skin diseases and wound healing processes?
- Can we generate a skin model for tissue engineering purposes by using different dermal scaffolds?
In the following sections a brief overview of the obtained results will be discussed and some of these results will be put in perspective.
Requirement of growth factors for epidermal reconstruction and basement membrane formation
Many investigators have attempted to develop human skin equivalents for scientific use or for the restoration of full-thickness defects. Most of the studies have been performed with epidermis reconstructed on acellular matrices (e.g. inert filter, cell-free De-epidermized dermis (DED)) (Freeman et al., 1976; Rosdy and Claus, 1990).
In the absence of exogenous growth factors, the epidermis reconstructed on these matrices shows a very poor morphology (chapter 2, 3 and 4). In addition, several essential basement membrane (BM) proteins (e.g. laminin 5, collagen type IV and VII) are not synthesized indicating that the attachment of the epidermis to the underlying surface is not optimal (chapter 4). Therefore engineering of these epidermal equivalents necessitates supplementation of growth factors to the medium in which they are grown. Despite epidermal growth factor (EGF) shows the highest potency to stimulate keratinocyte proliferation and to affect epidermal morphogenesis, other growth factors (GM-CSF, KGF, IGF-I, TGF-b) (Chapter 3) have been demonstrated to exert similar effects as well (Gibbs et al., 2000).
The use of relatively high concentrations of EGF in the engineering of reconstructed epidermis has always been erroneously encouraged by a number of investigators (Smola et al., 1998; Horch et al., 2000). We have clearly demonstrated that high concentrations of EGF, added to the culture medium, result in a formation of an abnormal BM and of a hyperproliferative epidermis, as judged by the expression of a number of different protein markers. It became also clear that the functionality and formation of the laminin 5 chains (a3b3g2) relies on the presence of growth factors. This molecule plays a very important role in assembling the extracellular matrix. Results presented in this study also demonstrated with RT-PCR that the laminin 5 a3-chain was not expressed in growth-factor-free organotypic keratinocyte monocultures as jugged with immunohistochemistry. This signifies that laminin 5 lost its full functionality in the BM. Conversely, when low concentrations of EGF, KGF or GM-CSF were added to the culture medium; all chains of laminin 5 (a3, b3, g2) were synthesized and the protein was deposited at the dermal-epidermal junction. The requirement of supplementation with exogenous growth factors for laminin 5 assembly (deposition) has not been respected till now (Zhang and Kramer, 1996; Smola et al., 1998; Adriani et al., 2003).
Addition of exogenous growth factors to culture media to engineer reconstructed epidermis is until now a requisite, although we have to take into account that addition of one or more growth factors activates only a restricted number of pathways and not a cascade of signalization routes as occurs in the in-vivo situation, where the epidermis is supported by a dermis containing different cell types.
Fibroblasts fully support epidermal morphogenesis and basement membrane formation in a HSE
By seeding keratinocytes onto a dermal substrate populated with fibroblasts, a full-thickness HSE can be established. Studies described in chapter 2 and 3 clearly illustrate that fibroblasts incorporated into the dermal matrices can completely substitute exogenous growth factor supplementation. Furthermore, it became clear that for achievement of an optimal epidermal morphogenesis, the presence of specific numbers of fibroblasts within the dermal matrix is required. Next to the fibroblast number also the functional state of the fibroblasts affected the expression of the hyperproliferation markers (K6, K16 and K17) and cornified envelope proteins (SKALP, involucrin, SPRR2). The functional state of the fibroblasts depends on the culture time of fibroblasts within the dermal compartment prior to seeding of keratinocytes. A prolonged culture period allows the fibroblasts to proliferate, synthesize extracellular matrix (ECM), remodel the collagen fibers and to stabilize growth factor secretion. As a result of this, the number of fibroblasts incorporated into the dermal substrate could be reduced to numbers that are found in native dermis. Coulomb and co-workers (Coulomb et al., 1998) had already demonstrated the advantages of the presence of fibroblasts in a human skin equivalent, but in most of their studies the importance of the optimal numbers and the functional state of fibroblasts present in matrices has not been addressed.
The role of fibroblasts in epidermal normalization becomes even more evident when their role in the BM formation is evaluated (chapter 4). In HSEs generated with fibroblast-free matrices in the absence of serum and exogenous growth factors, most of the BM components were absent (collagen type IV and VII, nidogen, laminin 1, 5 and 10). However, when fibroblasts were incorporated into collagen matrices, deposition of various BM components at the epidermal-matrix junction was detected. Especially it became clear that the formation and functionality of the laminin 5 a3-chain relies on the presence of fibroblasts, as only in the presence of fibroblasts laminin 5 decorated the epidermal-matrix junction. Further research also revealed that the assumption that laminins, and especially laminin 5, are indispensable for attachment of epidermal cells on the dermal substrate is not correct, as we have clearly demonstrated that integrins a1b1 and a2b1 and not laminins 1, 5 and 10/11 are adhesive ligands for the attachment of keratinocytes on fibroblast-free collagen matrices.
From the data presented in chapter 2, 3 and 4 it can be concluded that fibroblasts play a vital role in epidermal morphogenesis and basement membrane formation and in particular the specific numbers and the functional state of these cells within the dermal compartment have markedly improved these processes.
Direct keratinocyte-fibroblast contact is not required for establishment of a fully differentiated reconstructed epidermis
Results described in chapter 2, 3 and 4 indicate that the formation of a fully differentiated epidermis and of the BM is strongly regulated by fibroblasts. To answer the question whether the direct contact between keratinocytes and fibroblasts is required for the reconstruction of the epidermis, epidermis was generated in conditioned medium collected from organotypic fibroblast monocultures or organotypic keratinocyte-fibroblasts co-cultures. It became clear that the presence of soluble factors excreted by fibroblasts and/or keratinocytes was sufficient for establishment of fully differentiated epidermis and for the deposition of BM components, indicating that direct contact between keratinocytes and fibroblasts is not required (chapter 5). It remains still unclear which growth factor(s) released by fibroblasts and/or keratinocytes provides support for epidermal regeneration, as the levels of KFG and GM-CSF present in media collected from organotypic fibroblast or keratinocyte-fibroblasts co-cultures were found to be too low to sufficiently support epidermal morphogenesis and basement membrane formation. The future research should focus on this issue as it offers a challenge for the treatment of extensive wound defects with appropriate mixture of growth factors.
Fibroblasts facilitate re-epithelialization in a HSE
The wound-healing model presented in chapter 6 enables to study the potential role of fibroblasts in the re-epithelialization process. Two types of wounds were introduced: superficial wounds, in which only the epidermis is damaged and the underlying dermal compartment remains populated with functional fibroblasts, and full-thickness wounds, in which both the keratinocytes and fibroblasts are damaged and fully functional fibroblasts are present only in uninjured regions. Results presented in chapter 6 show that, as in-vivo, also in-vitro re-epithelialization of superficial wounds proceeds faster than that of full-thickness wounds, indicating the accelerating effect of fibroblasts in this process. This observation indicated that the epithelial-mesenchymal interaction plays an important role in establishing the profile of released factors regulating proliferation, differentiation and migration of keratinocytes. Administration of exogenous EGF or KGF facilitated wound closure only in the full-thickness wounds, in which the injured dermal compartment was deprived of viable fibroblasts.
Our findings further suggest that the presence of laminin 5, type IV and VII collagen in the laterally expanding epidermis is not required for keratinocyte migration in-vitro as they were not expressed at the periphery of the non-injured cultures. In these cultures the epidermal protein profile was changing from the central region towards the periphery. From various proteins we identified one protein (DJ-1) the level of which was decreasing from the central region towards the culture periphery. It has been suggested that DJ-1 plays a role in the oxidative stress response (Mitsumoto et al., 2001), the fertilization process (Wagenfeld et al., 1998, 2000) and cell transformation (Takahashi et al., 2001), but the precise function of DJ-1 is still unknown. More recently, structural analysis suggested that DJ-1 might be a protease (Tao et al., 2003). Therefore, further extensive studies must be performed to unravel the potential role of this protein in the regulation of the re-epithelialization process.
In wounded tissue various cells may migrate into the wounded area. Next to dermal fibroblasts also fibroblastic cells originating from the underlying adipose tissue may affect the processes of wound closure (chapter 7). To answer the question whether the tissue from which the fibroblasts originate is important for epidermal regeneration, HSE were established on matrices populated either with dermal fibroblasts (SPS) or adipose derived cells (ADCs). Various differences have been observed between these skin reconstructs. On matrices populated with SPS fibroblasts a marked lateral epidermal expansion took place while on matrices populated with ADCs it hardly occurred. Similar findings have been reported by Moulin in HSE generated with a dermal matrix populated with myofibroblasts (Moulin et al., 2000). Furthermore, we also observed that ADCs preserve their phenotype and induce marked contraction of the matrices. Under mechanical stress, ADCs will differentiate into proto-ADCs, which form cytoplasmic actin-containing stress fibers that terminate in fibronexus adhesion complexes. Functionally, these cells can generate contractile forces resulting in shrinkage of the dermal compartment. The microfilamentous (contractile) apparatus of these cells contains actin and myosin and in particular á-smooth muscle actin (Hinz et al., 2001; reviewed in Tomasek et al., 2002.). Dermal fibroblasts do not contain such a contractile mechanism. Moreover in this study two proteins CRABPII and BASPI were identified in SPS and not in ADCs (addendum to chapter 7). The exact role of these proteins in fibroblastic cells is still unknown and requires further research. Remarkably, profound accumulation of the ADCs underneath the epidermal compartment was noticed, similarly as in a scar tissue. Presently, it is unclear which factor(s) synthesized and secreted by keratinocytes is the driving force in this process. Also little is known about the factors released by ADCs and whether their production is modulated by dermal fibroblasts and/or kera
A possible role for fibroblasts in epidermal normalization in recessive epidermolysis bullosa simplex (REBS)
The use of a HSE offers the possibility to incorporate next to healthy cells also diseased cells. Only a limited number of in vitro studies with cells derived from diseased skin has been performed so far. Bernerd and co-workers (Bernerd et al., 2001) have successfully cultured several strains of primary xeroderma pigmentosum (XP) keratinocytes and XP fibroblasts from skin biopsies of XP patients and they effectively generated a HSE with these cells. Satisfactory features of stratification were obtained, but the expression of epidermal differentiation products, such as keratin K10 and loricrin, were delayed and reduced. This study demonstrated that XP skin could now reliably be reconstructed in vitro and thus defines a human model suitable for the study of genetic DNA repair defect (photosensitivity) with accurate three-dimensional tissue architecture in vivo. The role of fibroblasts in skin diseases in which hyperproliferation and/or elevated keratinocyte activation is a common element (e.g. psoriasis) can not be studied using this HSE model as keratinocytes frequently express markers associated with hyperproliferation features and increased proliferation rate. In contrast, a genetic skin disease in which hyperproliferation is not a direct result of various inborn errors of metabolism can be studied using this HSE.
Many investigators in dermatology focus their interest on keratinocytes in recessive epidermolysis bullosa simplex (REBS). The study described in Chapter 8 aimed to answer the question whether this skin disorder can be reproduced under the in vitro conditions. To overcome the limited availability of skin samples derived from the patient we have established an organotypic culture by placing a skin punch biopsy onto a dermal matrix and subsequent culture at the air-liquid interface. As HSE can be generated under controlled conditions, this approach allows to introduce cells from diseased and healthy skin and to study the interaction among the different cell types. This approach allowed us to establish that fibroblasts play an important role in manifestation of this skin disorder in vitro, as normal epidermal architecture was established when the dermal matrix was populated with fibroblasts originating from healthy donor. The hypothesis is that the compensating effect of the healthy fibroblasts described in chapter 8 is caused by complex interactions with the keratinocytes and/or ECM. Various studies have documented the importance of mesenchymal cells for keratinocyte growth and differentiation in culture (Smola et al., 1998; Stark et al., 1999; Maas-Szabowski et al, 1999, 2000). Furthermore, one can hypothesize that fibroblasts secrete unknown factor(s) that stabilize REBS keratinocytes lacking K14. Fractionation of soluble factors and screening them for their biological activity from conditioned media using an array of chromatographic techniques can potentially lead to identification of the active compound(s) regulating epidermal morphogenesis. Alternatively, this procedure can be shortened by the application of the novel promising technique SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture) (Ong et al., 2002) which, in combination with nano-LC-MS/MS, gives the opportunity to directly screen for differentially expressed (secreted) proteins between healthy and “diseased” fibroblasts. These would be p
Generation of multicellular human skin equivalents
After fifteen years of clinical testing, the FDA finally approved HSE as wound cover products that help regeneration of skin that is extensively damaged by burns or other trauma. Most of these transplanted HSE are generated with two different cell types, keratinocytes and/or fibroblasts. To generate a HSE that fulfills the fundamentals for an optimal wound cover product, the dermal matrix needs to be: biocompatible, biodegradable, from non-human origin and contain an endothelial network. Moreover, the cell sources (e.g. keratinocytes, melanocytes, fibroblasts) must be originating from one individual to avoid difficulties with the graft take and cultured in medium free of animal serum. In chapter 9 we developed a multicellular human skin equivalent from one single cell biopsy. By using different approaches, we finally succeeded in generating a HSE with four different cell types: keratinocytes, melanocytes, fibroblasts and endothelial cells. Epidermis reconstructed onto this dermal matrix showed a normal development and architecture. The endothelial network could only be established when fibroblasts were present in the dermal compartment and basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor were supplemented to the culture media. In the cultures established with rat collagen matrix, only lateral and not vertical expansion of endothelial cells occurred. However, a marked improvement of spatial organization of endothelial network was achieved when first dermal cells were seeded on the underside of an inert filter and subsequently epidermal cells on the top of it. Fibroblasts formed extracellular matrix throughout which numerous branched tubes were spreading. They also facilitated basement membrane formation at the dermal/epidermal junction. The results described in this chapter open new perspectives in generation of multicellular skin equivalents from a single skin biopsy that can be engineered to cover different skin injuries without complications in graft take. The potential development of bio
Therefore, the next step was to generate a dermal scaffold that embraces biocompatible and biodegradable features. In chapter 10 we investigated the role of different dermal scaffolds (PEGT/PBT, collagen, DED, fibrin) on epidermal morphogenesis. This kind of quality control is likely to be vital for successful transplantation of full skin equivalents in patients. The importance of normalized epidermis is essential in the control of tissue homeostasis and protection against bacteria. From this study it became clear that the use of fibrin as a new dermal scaffold opens new perspectives as this material contains most of the characteristics needed to develop a full human skin equivalent that can be used for clinical purposes.
Although we have now reached a level in which HSE resembles native skin to very high degree, total resemblance will be very difficult to achieve. Nevertheless, the combination of tissue, genetic and protein engineering offers hope of reaching that aim much faster. One can imagine, that living implants incorporated into the cell populated dermal matrix can act as a delivery-machine of specific proteins, growth factors, therapeutics etc. Beside this approach, cell engineering offers also the possibility to modify the programmed stem cell, with the intention to produce nerves, hair follicles and blood vessels.
References
Andriani F, Margulis A, Lin N, Griffey S, Garlick JA. Analysis of microenvironmental factors contributing to basement membrane assembly and normalized epidermal phenotype. J. Invest. Dermatol 2003; 120; 923-931
Bernerd F, Asselineau D, Vioux C, Chevallier-Lagente O, Bouadjar B, Sarasin A, Magnaldo T. Clues to epidermal cancer proneness revealed by reconstruction of DNA repair-deficient xeroderma pigmentosum skin in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 7817-7822
Coulomb B, Friteau L, Baruch J et al. Advantage of the presence of living dermal fibroblasts within in vitro reconstructed skin for grafting in humans. Plast Reconstr Surg 1998; 101: 1891-903
El Ghalbzouri A, Gibbs S, Lamme E et al. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. Br J Dermatol 2002 ;147: 230-243.
El Ghalbzouri A, Lamme E, Ponec M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell Tissue Res 2002; 310: 189-199
Freeman AE, Igel HJ, Herrman BJ, Kleinfeld KL. Growth and characterization of human skin epithelial cell cultures. In Vitro 1976; 12: 352-362
Gibbs S, Silva Pinto AN, Murli S, Huber M, Hohl D, Ponec M. Epidermal growth factor and keratinocyte growth factor differentially regulate epidermal migration, growth, and differentiation. Wound Repair Regen 2000; 8: 192-203
Hinz B, Celetta G, Tomasek JJ, Gabbiani G, Chaponnier C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Mol Biol Cell 2001; 12: 2730-2741
Horch RE, Debus M, Wagner G, Stark GB. Cultured human keratinocytes on type I collagen membranes to reconstitute the epidermis. Tissue Eng. 2000; 6: 53-67
Li W, Nadelman C, Henry G, Fan J, Muellenhoff M, Medina E, Gratch NS, Chen M, Han J, Woodley D. The p38-MAPK/SAPK pathway is required for human keratinocyte migration on dermal collagen. J Invest Dermatol 2001;117:1601-1611
Maas-Szabowski N, Shimotoyodome A, Fusenig NE. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci 1999; 112: 1843-1853
Maas-Szabowski N, Stark HJ, Fusenig NE. Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-1-induced keratinocyte growth factor expression in resting fibroblasts. J Invest Dermatol 2000; 114: 1075-1084
Mitsumoto A, Nakagawa Y, Takeuchi A, Okawa K, Iwamatsu A, Takanezawa Y. Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increased in response to sublethal levels of paraquat. Free Radic Res 2001; 35: 301-310
Moulin V, Auger FA, Garrel D et al. Role of wound healing myofibroblasts on re-epithelialization of human skin. Burns 2000; 26: 3-12.
Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics 2002 ;1: 376-386
Niessen FB, Andriessen MP, Schalkwijk J, Visser L, Timens W Keratinocyte-derived growth factors play a role in the formation of hypertrophic scars. J Pathol 2001; 194: 207-216
Rosdy M and Clauss LC. Terminal epidermal differentiation of human keratinocytes grown in chemically defined medium on inert filter substrates at the air-liquid interface. J Invest Dermatol 1990; 95: 409-414
Smola H, Stark HJ, Thiekotter G et al. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp Cell Res 1998; 239: 399-410
Stoll SW, Kansra S, Elder JT. Keratinocyte outgrowth from human skin explant cultures is dependent upon p38 signaling. Wound Repair Regen 2003; 11: 346-353
Szabowski A, Maas-Szabowski N, Andrecht S, Kolbus A, Schorpp-Kistner M, Fusenig NE, Angel P. c-Jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymal-epidermal interaction in skin. Cell 2000; 103: 745-755
Takahashi K, Taira T, Niki T, Seino C, Iguchi-Ariga SM, Ariga H. DJ-1 positively regulates the androgen receptor by impairing the binding of PIASx alpha to the receptor. J Biol Chem 2001; 276: 37556-37563
Tao X and Tong L. Crystal structure of human DJ-1, a protein associated with early-onset Parkinson’s diseasec. J Biol Chem 2003; 278: 31372-31379
Tomasek JJ, Gabbiani G, Hinz B, Chaponnier C, Brown RA. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3349-3363
Wagenfeld A, Gromoll J, Cooper TG. Molecular cloning and expression of rat contraception associated protein 1 (CAP1), a protein putatively involved in fertilization. Biochem Biophys Res Commun 1998; 251: 545-549
Wagenfeld A, Yeung CH, Shivaji S, Sundareswaran VR, Ariga H, Cooper TG. Expression and cellular localization of contraception-associated protein. J Androl 2000; 21: 954-963
Zhang K and Kramer RH. Laminin 5 deposition promotes keratinocyte motility.Exp. Cell Res. 1996; 15: 309-322.