Auteur: A.J. van der Slot-Verhoeven
Promotiejaar: 2005
Samenvatting:
Collageen
Collageen is een eiwit dat waarschijnlijk iedereen kent van cosmetische behandelingen om ingevallen mondhoeken op te vullen en rimpeltjes weg te werken. Er zijn echter maar weinig mensen die weten dat ongeveer 30% van de totale eiwit massa in ons lichaam collageen is en dat het een zeer belangrijke functie in ons menselijk lichaam vervult. Elk weefsel is opgebouwd uit cellen met daaromheen collageen. Dit collageen vormt samen met verschillende andere eiwitten de extracellulaire matrix. De extracellulaire matrix kan je eigenlijk vergelijken met lijm, het zorgt ervoor dat de cellen bij elkaar blijven en dat het weefsel structuur en stevigheid heeft. Collageen is opgebouwd uit drie aparte strengen die als een helix opgerold zijn. Het deel van het collageen dat deze helix structuur heeft noemen we de triple helix.
Aan elke kant van deze triple helix zitten rafelige uiteinden. Dit noemen we de telopeptiden. De bouwstenen van elke collageenstreng zijn aminozuren. Nadat het collageen in de cel geproduceerd is, wordt het uitgescheiden. Buiten de cel wordt het collageen geordend neergelegd in bundels (fibrillen). Om deze fibrillen stevigheid te bieden worden collageenmoleculen uiteindelijk onderling aan elkaar vast geknoopt door middel van een verbinding, een cross-link genaamd. Er bestaan verschillende soorten cross-links en het collageen in elk weefsel is verbonden door middel van een specifieke cross-link die precies past bij de structuur en functie van het weefsel. Bot bijvoorbeeld moet heel stevig zijn en heeft een hele andere structuur dan bijvoorbeeld huid die heel soepel is. Het collageen in deze weefsels is dan ook door middel van verschillende cross-links met elkaar verbonden.
Collageen cross-links
Zoals eerder vermeld is een cross-link een verbinding tussen meerdere collageenmoleculen. Deze verbindingen komen alleen op bepaalde plaatsen binnen het collageenmolecuul voor. Zo hebben de telopeptiden aan beide kanten ieder één plaats en de triple helix in totaal twee plaatsen die betrokken zijn bij een cross-link. Het hangt ervan af welk aminozuur zich er op deze specifieke plaatsen bevindt welke verbinding er uiteindelijk ontstaat. Er kunnen twee soorten verbindingen gevormd worden: de allysine cross-links en de hydroxyallysine cross-links. Welke van deze twee soorten gevormd wordt, is afhankelijk van het aminozuur op de verbindingsplaats in het telopeptide. Bevindt zich op deze plek het aminozuur lysine dan zal uiteindelijk een allysine cross-link gevormd worden. Is het aminozuur op deze plek een hydroxylysine dan zal er een hydroxyallysine cross-link gevormd worden. Als we weer kijken naar bot en huid dan zien we dat het collageen in bot met name door middel van hydroxyallysine cross-link verbonden is, terwijl in huid deze cross-links nauwelijks voorkomen en het collageen voornamelijk door middel van allysine cross-links verbonden is. De verandering van een lysine in het telopeptide in een hydroxylysine noemen we hydroxylering en is dus erg belangrijk voor de uiteindelijke vorming van het soort cross-links. Als dit niet goed gebeurt kan dat grote gevolgen hebben.
Het Bruck syndroom is hier een goed voorbeeld van. Patiënten met dit syndroom hebben een verandering van het soort cross-links in het bot. Men heeft ontdekt dat het collageen in het bot van deze patiënten is verbonden door middel van allysine cross-links in plaats van hydroxyallysine cross-links zoals het collageen normaal in bot verbonden is. Dit is het gevolg van de afwezigheid van hydroxylysines op de verbindingsplaats in de collageen telopeptiden. Als we naar de symptomen van dit syndroom kijken zien we dat deze verandering in het type cross-link grote gevolgen heeft voor het bot van deze patiënten. Bruck syndroom patiënten breken heel snel hun botten. Als we naar de structuur van het botweefsel kijken zien we dat de hoeveelheid mineraal, dat in bot aanwezig is, sterk verminderd is. Verder zien we dat het botweefsel sneller afgebroken wordt dan normaal. Deze bevindingen laten dus zien dat voor de functie en structuur van het weefsel het erg belangrijk is dat het collageen op de juiste manier gecross-linkt wordt.
Collageen cross-links in fibrose
Een ander ziektebeeld, waarin een verandering in het type cross-link ontstaat, is fibrose. Fibrose is een algemeen pathologisch (ziekte) proces dat wordt gekarakteriseerd door een overmatige ophoping van collageen. Dit proces komt in vele weefsels en organen voor en is het eindstadium van vele ziekteprocessen zoals: brandwonden, keloid, systemische sclerodermie, en vele long-, lever- en nierziektes. De overmatige ophoping van collageen is het resultaat van een verschil tussen de aanmaak en afbraak van collageen. In verschillende fibrotische weefsels is een verhoogde aanmaak van collageen gevonden, terwijl de activiteit van enzymen die collageen kunnen afbreken sterk verlaagd is. Veel therapieën om fibrose aan te pakken richten zich dan ook op de verlaging van collageen aanmaak en de verhoging van de activiteit van collageen afbrekende enzymen. Een interessant feit, dat weinig aandacht krijgt, is dat gedurende fibrose ook de collageen cross-link soort verandert. Gedurende fibrose ontstaat er een verschuiving van allysine naar hydroxyallysine cross-links wat leidt tot een verhoogde aanwezigheid van hydroxyallysine cross-links in het collageen. Als we bijvoorbeeld naar brandwonden kijken zien we dat het aanwezige collageen in dit weefsel meer hydroxyallysine cross-links bevat dan normale huid.
Hypothese en doel van de studie
Er zijn veel indirecte aanwijzingen dat collageen dat hydroxyallysine cross-links bevat, moeilijker afbreekbaar is door collageen-afbrekende enzymen dan collageen dat allysine cross-links bevat. We denken nu dat de verhoogde aanwezigheid van hydroxyallysine cross-links in fibrotische weefsels ertoe leidt dat het collageen moeilijker afbreekbaar is. Dit zou dan ook een oorzaak kunnen zijn waarom het collageen zich uiteindelijk ophoopt in deze weefsels. Direct bewijs hiervoor is echter nog nooit geleverd. De studie beschreven in hoofdstuk 2 van dit proefschrift laat zien dat collageen dat hydroxyallysine cross-links bevat inderdaad moeilijker afbreekbaar is dan collageen dat allysine cross-links bevat. Verder laat een muizenstudie zien dat het type cross-link (allysine of hydroxyallysine) de uitkomst van het fibrotisch proces beïnvloedt. Wanneer het collageen in fibrotische weefsels geen verhoogde hoeveelheden hydroxyallysine cross-links bevat, blijkt de collageen ophoping vanzelf weer te verdwijnen en dus omkeerbaar te zijn. Deze studie geeft aanwijzingen dat door de verhoogde aanwezigheid van hydroxyallysine cross-links het collageen inderdaad minder vatbaar voor afbraak is, wat uiteindelijk leidt tot de ongewenste ophoping van collageen in het weefsel. De onomkeerbare collageenophoping gedurende fibrose is dus niet alleen het gevolg van verhoogde collageenaanmaak en verlaagde activiteit van collageen-afbrekende enzymen, maar de verhoging in hydroxyallysine cross-links heeft hierop ook invloed. Therapieën om fibrose tegen te gaan moeten zich daarom niet alleen richten op de verlaging van collageenaanmaak en de verhoging van de activiteit van collageen-afbrekende enzymen, maar zal zich ook moeten richten op het verlagen van de vorming van hydroxyallysine cross-links om zo het collageen makkelijker afbreekbaar te maken. Methodes om de vorming van hydroxyallysine cross-link specifiek te remmen waren tot dusver nog niet beschreven, omdat het precieze mechanisme dat ten grondslag ligt aan de vorming van deze cross-link nog niet opgehelderd was. Het doel van de verdere studie van dit proefschrift was inzicht te krijgen hoe deze hydroxyallysine cross-links gevormd worden om zo een manier te vinden om de vorming van deze cross-links in fibrose specifiek aan te pakken. De verschuiving van allysine naar hydroxyallysine cross-links in fibrose wordt veroorzaakt door een verhoogde hoeveelheid hydroxylysines in de telopeptiden. Dit betekent dus dat er meer lysines in de telopeptiden naar hydroxylysines omgezet zijn. Enzymen die ervoor zorgen dat een lysine naar hydroxylysine omgezet wordt zijn lysylhydroxylases. Inmiddels zijn er drie verschillende lysyl hydroxylases beschreven namelijk lysyl hydroxylase 1 (LH1), LH2 en LH3. Van LH1 is bekend dat het specifiek de lysine residuen in de triple helix van het collageenmolecuul hydroxyleert. Van LH2 en LH3 was nog niets bekend. Tot dusver waren er veel aanwijzingen dat er een specifiek enzym moest zijn dat juist alleen de lysine residuen in het telopeptide hydroxyleert maar of dat LH2 of LH3 is of juist een ander enzym, wist men nog niet. Omdat de verhoogde formatie van hydroxylysines in fibrotische weefsels waarschijnlijk het gevolg is van een verhoogde activiteit van een dergelijk telopeptide lysyl hydroxylase was het erg interessant om dit enzym te identificeren.
Bruck syndroom: de identificatie van LH2 als telopeptide lysyl hydroxylase
Zoals eerder gezegd bevat het collageen in bot van Bruck syndroom patiënten nauwelijks telopeptide hydroxylysines. Deze patiënten hebben dus een niet goed functionerend telopeptide lysyl hydroxylase in het bot. Omdat dit syndroom een erfelijke ziekte is zullen deze patiënten een fout in de genetische informatie (DNA) hebben dat beschrijft hoe dit enzym eruit moet zien. In hoofdstuk 3 wordt een studie beschreven waarin we het DNA van verschillende Bruck syndroom patiënten hebben bekeken. Het blijkt dat deze patiënten een fout hebben in het DNA dat beschrijft hoe het enzym LH2 eruit moet zien. Deze Bruck syndroom patiënten laten dus zien dat LH2 een telopeptide lysyl hydroxylase is.
Interessant is dat er Bruck patiënten zijn die geen fouten hebben in het DNA dat beschrijft hoe LH2 eruit moet zien. Deze patiënten zullen geen fouten hebben in de opbouw van het LH2 enzym. Toch hebben ze exact hetzelfde probleem als de patiënten die wel een fout in het DNA hebben: er kunnen geen telopeptide lysine residuen in het bot gehydroxyleerd worden. Het Bruck syndroom blijkt dus verschillende oorzaken te hebben. We noemen de patiënten die geen fouten in LH2 hebben Bruck syndroom type I en patiënten die wel fouten in LH2 hebben noemen we Bruck syndroom type II. Wat er precies mis is met Bruck syndroom type I patiënten blijft een raadsel. Het zou kunnen zijn dat in de cellen van deze patiënten veel minder of misschien wel helemaal geen LH2 enzym aanwezig is. Dit zou een oorzaak kunnen zijn voor de verminderde activiteit van dit enzym. In hoofdstuk 4 wordt een studie beschreven waarin we de aanwezigheid van LH2 bekijken in verschillende celtypen van Bruck syndroom type I patiënten en de hoeveelheden vergelijken met de hoeveelheden in cellen afkomstig van gezonde mensen. Het LH2 enzym komt als twee varianten voor, namelijk LH2a en LH2b. Deze varianten zijn bijna identiek aan elkaar. LH2b bevat een extra tussenstuk van 21 aminozuren. Beide worden door hetzelfde DNA beschreven. In de studies hebben we beide varianten gemeten. Om inzicht te krijgen in de LH2a en LH2b enzym hoeveelheden kun je de hoeveelheden LH2a en LH2b enzym direct meten, maar je kunt ook de hoeveelheden voorloper van een enzym, het mRNA, meten. Omdat er nog geen methode bestond om LH2a en LH2b enzym hoeveelheden direct te meten hebben we in onze studies steeds LH2a en LH2b mRNA hoeveelheden gemeten.
Onze experimenten lieten zien dat de hoeveelheden LH2a en LH2b in de patiënten cellen normaal zijn. Dus er moet een andere oorzaak zijn voor de verlaagde LH2 activiteit in Bruck syndroom type I patiënten. We denken nu dat LH2 voor het goed functioneren nog een hulpfactor nodig heeft en dat Bruck syndroom type I patiënten deze hulpfactor missen. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen wat deze factor is.
Aanwezigheid van LH2b in fibrose
Toen we aanwijzingen hadden dat LH2 een telopeptide lysyl hydroxylase is, was het bijzonder interessant om te onderzoeken of in cellen die afkomstig zijn uit fibrotische weefsels dit LH2 enzym verhoogd aanwezig is. Het collageen dat zich in deze weefsels bevindt bevat immers meer hydroxylysines in de telopeptiden. Dit wijst op een verhoogde aanwezigheid van het telopeptide lysyl hydroxylase. En inderdaad de hoeveelheid LH2b mRNA is sterk verhoogd in cellen afkomstig uit fibrotische weefsels ten opzichte van cellen uit gezonde huid (hoofdstuk 5). LH2a is nauwelijks aanwezig in gezonde en fibrotische cellen. Deze variant van LH2 zal dus niet echt een belangrijke rol vervullen in fibrotische processen. Als we deze cellen in een kweekflesje collageen laten maken blijkt dat de fibrotische cellen collageen produceren dat een verhoogde hoeveelheid hydroxyallysine cross-links bevat en dus meer hydroxylysine residuen heeft in de telopeptiden. De gevonden resultaten wijzen erop dat een verhoogde aanwezigheid van LH2b verantwoordelijk is voor de verhoogde vorming van hydroxylysines en de daarop volgende verhoogde vorming van hydroxyallysine crosslinks. De volgende vraag was hoe het komt dat de LH2b mRNA hoeveelheden in fibrotische cellen zo verhoogd zijn. Het is bekend dat gedurende het fibrotische proces verschillende afweercellen vanuit het bloed zich naar het betreffende weefsel verplaatsen en daar verschillende stoffen uitscheiden. Omdat deze stoffen het fibrotisch proces versterken, worden ze profibrotische stoffen genoemd. Deze profibrotische stoffen zorgen ervoor dat de collageenaanmaak in het weefsel omhoog gaat en dat de activiteit van collageen-afbrekende enzymen verlaagd wordt. Of deze profibrotische stoffen de hoeveelheid LH2b en zo ook de vorming van hydroxyallysine cross-links kunnen verhogen was nog niet beschreven. Om dit te onderzoeken hebben we huidcellen voor een bepaalde tijd gekweekt in aan- en afwezigheid van verschillende profibrotische stoffen. Vervolgens hebben we gekeken naar de hoeveelheid LH2b mRNA in deze cellen
(hoofdstuk 6). De LH2b mRNA hoeveelheid bleek inderdaad sterk verhoogd te zijn in cellen die behandeld zijn met profibrotische stoffen ten opzichte van onbehandelde cellen. Verder hebben we het collageen vergeleken dat geproduceerd werd door cellen gekweekt met en zonder profibrotische stoffen. Het bleek dat de profibrotische stoffen de formatie van hydroxyallysine cross-links ook verhogen. Deze experimenten laten zien dat gedurende het fibrotisch proces, profibrotische stoffen de hoeveelheid LH2b mRNA verhogen. Dit leidt tot meer hydroxylysines in het telopeptide en uiteindelijk tot een verhoogde vorming van hydroxyallysine cross-links.
LH2b remmers
Nu we verschillende aanwijzingen hebben verkregen dat gedurende fibrose een verhoogde aanwezigheid van LH2b verantwoordelijk is voor de toename in hydroxyallysine cross-links, was het laatste doel van dit proefschrift het zoeken naar manieren om de hoeveelheid LH2b enzym omlaag te brengen. Een verlaging van de hoeveelheid LH2b enzym zal leiden tot een verlaagde vorming van hydroxyallysine cross-links. Dat is immers wat we willen. Minoxidil, een bekend medicijn dat gebruikt wordt als bloeddrukverlager, leek een geschikte kandidaat. Van minoxidil was bekend dat het de hoeveelheid lysyl hydroxylases in het algemeen verlaagd. Er was echter nog nooit gekeken welk lysyl hydroxylase (LH1, LH2 of LH3) wordt verlaagd. Als minoxidil een specifiek remmend effect heeft op LH2b dan zou het een geschikte kandidaat zijn voor de behandeling van fibrose. Het was daarom erg interessant om te achterhalen wat het effect van minoxidil op de verschillende lysyl hydroxylases is. Helaas was het remmend effect van minoxidil het sterkst op LH1 en in mindere maten op LH2b hoeveelheid (hoofdstuk 7). Verder was minoxidil ook niet in staat de vorming van hydroxyallysine cross-links te verlagen. Minoxidil is dus geen geschikt middel voor de behandeling van fibrose.
Een andere manier om LH2b mRNA te verlagen is door middel van het gebruik van small interfering RNA moleculen (siRNA). siRNA moleculen zijn korte moleculen die een zeer specifieke opbouw hebben (opgebouwd uit dezelfde bouwstenen als het mRNA). Wanneer ze in de cel gebracht worden hechten ze aan een bepaald mRNA molecuul. Zodra dit siRNA molecuul is gebonden, vormt het siRNA met het mRNA en met een aantal andere eiwitten in de cel een complex. Uiteindelijk zal dit leiden tot de specifieke afbraak van het mRNA. Omdat het mRNA de voorloper van een eiwit is kan er op deze manier geen eiwit meer gemaakt worden. In ons geval zullen LH2b siRNA’s in de cel aan het LH2b mRNA binden wat ertoe leidt dat het LH2b mRNA afgebroken wordt. Uiteindelijk zal er geen LH2b enzym gemaakt worden wat uiteindelijk tot gevolg heeft dat er minder telopeptide lysine residuen gehydroxyleerd zullen worden. In hoofdstuk 8 van dit proefschrift beschrijven we een studie waarin we LH2b-siRNA’s hebben ontwikkeld. Deze studie laat zien dat LH2b-siRNA’s in staat zijn om het LH2b mRNA in de cel te verlagen. Helaas was dit effect van LH2b-siRNA maar van korte duur en zijn we tot op heden nog niet in staat geweest om de duur van dit effect te verlengen. Dit betekent dat we ook nog niet in staat zijn geweest om te bekijken wat het effect van LH2b-siRNA op de vorming van hydroxyallysine cross-links is. Om genoeg collageen te verkrijgen om cross-link metingen uit te voeren moeten de cellen vier weken gekweekt worden. Het effect van het LH2b-siRNA moet dan ook enkele weken aanhouden en dat hebben we tot dusver nog niet voor elkaar gekregen. Maar de resultaten van deze studie bieden wel perspectief voor de toekomst.
Conclusie
Dit proefschrift beschrijft de identificatie van het enzym LH2b als het telopeptide lysyl hydroxylase dat betrokken is bij de vorming van hydroxyallysine cross-links in fibrose. Deze studie heeft ons enerzijds een stap dichterbij gebracht in de ontrafeling van het fibrotisch proces. Anderzijds heeft het ons nieuwe inzichten gegeven in de ontwikkeling van medicijnen die de vorming van hydroxyallysine cross-links specifiek kunnen remmen om uiteindelijk de ongewilde collageenophoping in verschillende fibrotische ziektes tegen kunnen gaan.