2003_Proefschrift_Pol, A. Auteur: A. Pol
Promotiejaar: 2003
ISBN-10: 90-9017420-6

Samenvatting

De menselijke huid bestaat uit het bindweefsel van de dermis (lederhuid), waarover het gelaagde weefsel van de epidermis (opperhuid) ligt. De epidermis is een dynamisch weefsel, dat voornamelijk bestaat uit keratinocyten die deelnemen aan een sterk gecoördineerd proces welke bepalend is voor de vorming van een barrière tussen het externe milieu en het menselijk lichaam. Tijdens dit proces vindt er een overgang plaats van delende keratinocyten vanuit de binnenste, basale cellaag van de epidermis naar terminaal gedifferentieerde keratinocyten welke de dode, stevige, buitenste laag van de huid vormen. In normale huid ligt een complexe regulatie van genexpressie ten grondslag aan de precieze balans welke bestaat tussen celdeling en celdifferentiatie. Bij de huidziekte psoriasis is deze balans afwezig, hetgeen gekenmerkt wordt door de afwezigheid van de normale gelaagde structuur, de aanwezigheid van overmatig delende (hyperproliferatieve) keratinocyten in de zieke huid, alsmede een infiltraat van immuuncellen. Wat betreft de behandeling van deze huidziekte ligt het aangrijpingspunt van gangbare antipsoriatica op het gebied van ontsteking, hyperproliferatie, abnormale differentiatie of een combinatie van deze pathologische verschijnselen. De exacte werkingsmechanismen van de meest gangbare antipsoriatica zijn echter veelal nog onbekend. Door toepassing van o.a. proefdier- en celkweekgerelateerde modelsystemen, waarin aspecten van psoriasis bestudeerd kunnen worden, wordt getracht het precieze werkingsmechanisme van farmaca te ontrafelen ten einde de specificiteit ervan te verhogen en/of de bijwerkingen te reduceren.

Hoewel er in de afgelopen decennia een sterke kennistoename heeft plaatsgehad met betrekking tot de pathogenese van psoriasis, is de exacte etiologie nog onvolledig bekend, alsook de rol welke de diverse epidermale celpopulaties er mogelijk in hebben. In dit proefschrift dient de keratinocyt als uitgangspunt voor verdere kennisverwerving op dit gebied. De grondslag van de hoofdstukken 2, 4, en 5, wordt gevormd door de aanname dat het grootschalig gebruik van farmacologische testprogramma’s kan leiden tot de versnelde identificatie van potentiële kandidaten voor de behandeling van psoriasis. Hoofdstuk 2 beschrijft een methode die het mogelijk maakt om in 96-wells formaat farmaca te beoordelen op het vermogen de proliferatie van humane keratinocyten te beïnvloeden. Een panel bestaande uit stoffen met bewezen antipsoriatisch effect, alsmede enkele experimentele antipsoriatica, werd getest in een kweeksysteem waarbij celproliferatie gemeten werd door middel van een gevoelige fluorescentie-uitlezing gebaseerd op een DNA-bindende kleurstof (PicoGreen). Dithranol, een stof waarvan verondersteld wordt dat die rechtstreeks effect uitoefent op de epidermis, bleek een sterke remming op de groei uit te oefenen. Anti-psoriatica die waarschijnlijk via het immuunsysteem werken (cyclosporine A, CsA) of via differentiatie van de keratinocyt (all-trans-retinoïnezuur, ATRA) bleken de groei niet te remmen bij therapeutisch relevante concentraties. Validatie van het modelsysteem wordt bemoeilijkt door het feit dat zelfs voor de meest gangbare antipsoriatica geen sterk experimenteel bewijs bestaat, of consensus bereikt is, aangaande het exacte werkingsmechanisme in de patiënt.

Fenotypische verschillen tussen normale en psoriatische epidermis, met betrekking tot differentiatie, worden ondermeer gekarakteriseerd door de specifieke expressie van een aantal eiwitten. Binnen onze afdeling zijn voorheen reeds celkweekmodellen ontwikkeld, waarmee het normale fenotype en het psoriatische fenotype van humane epidermis nagebootst kan worden. In deze modellen kan expressie van cytokeratine 10 (CK10) en `skin-derived antileukoproteinase’ (SKALP) dienen als marker voor respectievelijk het normale en het psoriatische fenotype van keratinocytdifferentiatie. Hoofdstuk 3 geeft een beschrijving van de ontwikkeling van SKALP-specifieke monoklonale antilichamen en de toepassing ervan in een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). De monoklonale antilichamen overtroffen de bestaande polyklonale antilichamen wat betreft specificiteit en affiniteit. In opvolgend onderzoek werd deze ELISA toegepast in de kwantitatieve bepaling van concentraties gesecreteerd SKALP in het medium van gekweekte keratinocyten.

In hoofdstuk 4 wordt een screeningsmodel beschreven om farmacologisch actieve stoffen te detecteren in twee 96-wells kweeksystemen, waarin expressie van CK10 en SKALP gebruikt wordt als markers voor normale en psoriatische differentiatie van keratinocyten. In deze kweekmodellen werden zowel stoffen getest met een bewezen antipsoriatisch effect, alsmede enkele experimentele antipsoriatica. De bevinding dat fysiologische concentraties CsA geen effect hebben op beide differentiatiemarkers is in overeenstemming met de opvatting dat de specifieke immuunsuppressieve kenmerken van CsA bijdragen aan zijn antipsoriatisch effect. ATRA gaf naar verwachting een sterke remming van SKALP-expressie te zien. Het was daarbij opvallend dat de waargenomen daling van CK10 overeenkomt met literatuurgegevens die beschrijven dat ATRA de expressie van verschillende vroege en late markers die kenmerkend zijn voor de normale differentiatie (bijv. CK1, CK10, loricrine) kan verlagen. Dithranol veroorzaakte een sterke verlaging van SKALP-expressie. In combinatie met het hierboven beschreven effect op proliferatie impliceert dit een tweeledig effect van dithranol op de keratinocyt: vermindering van zowel hyperproliferatie als van afwijkende differentiatie. Het vitamine D3 derivaat calcipotriol veroorzaakte een sterke vermindering van CK10 , hetgeen tegenstrijdig is met eerdere beschrijvingen waarin vitamine D3 normale differentiatie juist bevorderd. Hoewel aanvullend onderzoek naar deze discrepantie benodigd is, lijkt het hier beschreven model niet toepasbaar te zijn voor het screenen van vitamine D3 derivaten.

Hoewel de expressie van SKALP een uiterst bruikbare marker is voor psoriatische differentiatie, wordt de bruikbaarheid ervan in grootschalige farmacologische testmodellen beperkt door de bewerkelijke, tijdrovende ELISA die nodig is voor de kwantificering van het gesecreteerde eiwit. Dit gegeven vormde de aanleiding om een methode te ontwikkelen waarbij de activiteit van de SKALP-promoter bepaald kon worden aan de hand van een praktischer uitlezing in de vorm van fluorescentie. In hoofdstuk 5 is weergegeven hoe een stabiel getransfecteerde keratinocyT cellijn gecreëerd is, die een fluorescerend eiwit (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) tot expressie brengt, dat onder controle staat van een 0.8-kb fragment van de endogene SKALP-promoter. De beweegreden om deze promoterlengte te gebruiken was gebaseerd op transiente transfectiestudies in normale humane keratinocyten waarin gevonden werd dat 800 bp gelegen voor de transcriptiestartplaats de volledige promoteractiviteit deden behouden (zie hoofdstuk 6). Inductie van de promoter met tumor necrosis factor alpha (TNF-a) resulteerde in verhoogde expressieniveaus van het gesecreteerde SKALP-EGFP fusie-eiwit, hetgeen aangetoond werd met directe uitlezing van fluorescentie en fluorescentie polarisatie in 96-wells platen. De combinatie van een relatief hoge intrinsieke fluorescentie van het medium en een laag expressieniveau van het transgen, resulteerden in een klein dynamisch bereik. Desondanks werd aangetoond dat een gesecreteerd EGFP-fusie-eiwit onder controle van een fysiologisch relevante endogene promoter, conceptueel bruikbaar is om op basis van fluorescentie een testsysteem te ontwikkelen waarin stoffen beoordeeld kunnen worden op hun effect ten aanzien van keratinocyt-gerelateerde differentiatie en ontsteking. Tot besluit van dit hoofdstuk wordt de suggestie voor toekomstig onderzoek gedaan, dat verbetering van het dynamisch bereik mogelijk bewerkstelligd kan worden door het EGFP-gen middels homologe recombinatie in de correcte genomische omgeving te plaatsen, zodat expressie gestuurd wordt door de correcte promoter en, flankerende sequenties.

We veronderstelden dat kennis aangaande de regulatie van SKALP op moleculair niveau informatief kon zijn met betrekking tot de moleculaire regulatie van het fenotype dat geassocieerd is met psoriatische epidermis en het daarbij behorende karakteristieke profiel van genexpressie. In hoofdstuk 6 wordt een studie beschreven die gericht is op de opheldering van de regulatie van SKALP-genexpressie in humane keratinocyten. Allereerst werd de startplaats van de transcriptie van het gen bepaald. Met twee verschillende technieken werd aangetoond dat het SKALP mRNA een zeer ongebruikelijk korte 5′-`untranslated region (5′-UTR) bezit. Verder wordt de constructie beschreven van een set promoter/reportergen plasmiden die vervolgens in transiente transfectie-experimenten werd gebruikt. Het bleek dat een gebied ter grootte van 440 bp, dat voor de transcriptie startplaats gelegen is, nog resulteert in hoge expressie van het construct in humane keratinocyten. Opvallend was dat de promoterconstructen niet onderhevig waren aan dezelfde regulatie als het endogene SKALP-gen. De constructen waren in hoge mate actief onder kweekomstandigheden die het psoriatisch fenotype van keratinocyten induceren alsook onder kweekomstandigheden die het normale fenotype induceren. Om meer inzicht te verkrijgen in het regulatoire mechanisme dat aan deze discrepantie ten grondslag ligt, werden SKALP-promoter constructen stabiel getransfecteerd in de HaCaT-keratinocytcellijn. Zowel het endogene gen als het transgen konden geïnduceerd worden door TNF-a, hetgeen suggereert dat genregulatie van SKALP afhankelijk is van chromatinestructuren. Toepassing van deze stabiel getransfecteerde klonen om effecten van farmacologische manipulatie op SKALP-expressie te bestuderen, bleek onmogelijk omdat het 4 kb SKALP-promoterfragment van een kloon, in tegenstelling tot de endogene SKALP-promoter, niet gevoelig bleek voor de negatieve regulatie door retinoïnezuur. Dit suggereert dat er additionele sequenties benodigd zijn voor de correcte regulatie van het SKALP-gen.

Het is wenselijk om het exacte werkingsmechanisme van een geneesmiddel te kennen omdat dit kan bijdragen tot een meer efficiënte therapie en een vermindering van ongewenste neveneffecten. Hiertoe kunnen DNA microarrays toegepast worden omdat hiermee (clusters van) genen onthuld worden die differentieel tot expressie komen waaruit informatie verkregen kan worden omtrent regulatoire mechanismen en biochemische paden binnen een cel. In hoofdstuk 7 wordt de toepassing beschreven van een cDNA-microarray (SKINarray) die is samengesteld uit 750 cDNAs die geacht worden relevant te zijn voor biologische processen van de huid of die een rol spelen in het proces van ontsteking. De SKINarray is gebruikt om de effecten van all-trans retinoïnezuur te bestuderen op de genexpressieprofielen van keratinocyten in de kweekmodellen voor het normale en psoriatische fenotype. De effecten van all-trans retinoïnezuur op epidermale groei en differentiatie zijn reeds uitgebreid bestudeerd, zowel in humane huid alsook in kweekmodellen. De beschikbare literatuurgegevens konden daarom tot op zekere hoogte dienen om de uitkomst van dit experiment te voorspellen en te valideren. De resultaten bevestigden het merendeel van de bekende effecten die ATRA heeft op humane epidermis en gekweekte keratinocyten. Daarnaast werd echter ook de regulatie van genen aangetoond waarvan nog niet bekend was dat ze onder controle staan van dit retinoid. In de nabije toekomst zal verificatie van de meest prominente resultaten plaatsvinden met behulp van alternatieve analysetechnieken (zoals kwantitatieve RT-PCR). Daarnaast zullen vergelijkbare studies uitgevoerd worden met andere bekende antipsoriatica waarmee beoogd wordt regulerende genen en paden te identificeren die bijdragen aan de pathogenese van psoriasis.

print