Afgerond in 2009
Projectduur: 1 jaar pilotstudie
Projectleider: R.H.J. Beelen – VUmc
Doelstelling
Doel van onze studie was het testen van potente anti-inflammatoire drugs met betrekking tot hun verbeterend effect op wondheling. Deze geneesmiddelen werden geselecteerd op basis van de literatuur en eigen preliminaire data (ook van uit andere ontstekingsmodellen uitgevoerd in onze groep). De kandidaten in deze waren montelukast (cysteïne leukotrien receptor antagonist), roxythromycine (antibioticum), celecoxib (cox-2 remmer) en laag moleculaire heparine (arixta). Onze resultaten uit deze pilot studie laten zien dat s.c. behandeling met arixta een significante reductie geeft van de wondcontractie na 6 weken, gepaard gaande met een veel lager aantal myobriblasten na 6 weken en lager mRNA levels van alfa-smooth muscle actine na 6 weken. Terwijl dit niet werd gevonden met montelukast of celecoxib. Deze duidelijke resultaten zijn in overeenstemming met eigen data in een ander ontstekingsmodel (peritoneale dialyse) en recente literatuur hierover maken arixta de ideale kandidaat voor een vervolgonderzoek in het wondhelingsmodel gecombineerd met stoffen geselecteerd uit pilotdata uit een andere NBS pilot (P07.02).
Achtergrond
Doel van deze pilot studie was om het effect van een 4-tal geneesmiddelen met mogelijke anti-inflammatoire werking te testen op de wondgenezing. Deze geneesmiddelen zijn goedgekeurd voor gebruik bij patiënten maar voor andere indicaties dan wondgenezing. Op basis van gegevens uit de literatuur en enkele data uit eerder onderzoek zijn de volgende stoffen geselecteerd: montelukast, celecoxib, fraxiparin, roxythromycin. Door tijdgebrek is de laatste stof niet getest. Dit was ook de meest onlogische stof als pure ontstekingsremmer: het is een antibioticum, maar meer informatie is het afgelopen jaar ook niet in de literatuur naar voren gekomen. In plaats van fraxiparin is arixtra getest, een low molecular weight heparin met minder bijwerkingen.
Methoden
De stoffen zijn getest in vitro en in vivo. Voor de in vitro experimenten werden humane monocyten gestimuleerd met LPS afkomstig van Pseudomonas bacteriën. Vervolgens werd een concentratiereeks van de te testen stof toegevoegd. De cellen werden 24h of 48h in een kweekstoof geplaatst waarna het kweekmedium geoogst werd. In dit medium werd met ELISA de productie van TNF-alfa, Il-1, Il-6 en TGF-beta bepaald. Als controles werden monocyten zonder LPS en zonder toevoeging van stoffen en monocyten alleen met LPS gestimuleerd meegenomen. Voor de in vivo experimenten is Montelukast getest in het half diepe excisiewondmodel dat eerder gebruikt was voor het testen van liposomen. In samenwerking met M.M.W. Ulrich (pilot 07.02) is een model opgezet (diep dermale brandwond). Celecoxib en arixtra zijn daarom getest in dit meer relevante wondgenezingsmodel.
Beknopte samenvatting van de resultaten
Montelukast toediening resulteerde op dag 7 in significant verminderde wondcontractie. Op de coupes van de wonden bleek echter dat de meeste wonden niet gesloten waren terwijl dit wel het geval was bij bijna alle controle. Het percentage van de wond wat weer bedekt is met keratinocyten was bij montelukast groep 83%, bij de controle groep is dit 99% (significant verschil, Mann-Whitney toets). Op de coupes van het weefsel waren er geen verschillen in aantallen ontstekingscellen (granulocyten en macrofagen) en myofibroblasten. Na 1 maand en na 4 maanden was er geen significant verschil meer in wondcontractie. Ook waren er geen verschillen te zien tussen de littekens, zoals de oriëntatie van de collageenvezels. In vitro bleek montelukast de productie van TNF-alfa na stimulatie met LPS juist te verhogen (maximaal 28% hoger). Ook de productie van Il-1 en Il-6 steeg met maximaal 45% wanneer montelukast toegevoegd was aan de cellen. Verwacht was dat juist montelukast de productie van deze pro-inflammatoire cytokines zou remmen. Mogelijk is dit wel een verklaring voor de resultaten; een hogere concentratie van deze cytokines activeert de ontstekingsreactie waardoor de uitgroei van de epitheelcellen geremd wordt. De productie van TGF-β door LPS gestimuleerde monocyten veranderde niet significant door toevoeging van montelukast. Al met al lijkt montelukast dus niet geschikt. LMW heparines zijn gerapporteerd als anti-inflammatoir in vitro en in vivo, wat in onze eigen peritoneaal dialyse model werd bevestigd (minder influx macrofagen en neutrofiele granulocyten (Schilte, Loreiro, Keuning, Wee, Celie, Beelen, van den Born, 2009. Long term intervention with heparins in a model of peritoneal dialysis Perit Dial int 29, 36-35) en een voorafgaand editorial in deze, alsmede meer recente literatuur in deze. In onze pilot bleek dat toediening van Arixta (s.c. op dag 1 en dag 4 na verbranding) resulteerde in significante vermindering van de contractie na 6 weken met maximaal 30%. Op dag 7 waren de wonden nog open, er was geen verschil in percentage van de wond wat weer bedekt was met epitheel. Op dag 21 waren alle wonden gesloten. Er waren kleine verschillen in de aantallen granulocyten (HIS 48) en macrofagen (ED-1 en ED-2), deze zullen nog verder gekwantificeerd worden. Het aantal myofibroblasten in de coupes op dag 7 was iets lager in de groep behandeld met Arixta, de hoeveelheid mRNA voor α-smooth muscle actin was ook in dezelfde mate verlaagd. Na 6 weken was het aantal myofibroblasten significant lager in de littekensdie met Arixta behandeld waren (met maximaal 20%). De hoeveelheid mRNA voor α-smooth muscle actin was ook op dit tijdstip verlaagd. Vanwege tijdgebrek binnen dit project was het niet mogelijk om de hoeveelheid mRNA voor TGF-beta in de weefsels te bepalen. Mogelijk kan dit in de vervolgstudie nader worden uitgezocht (AIO aanvraag ingediend bij NBS per 14-4-2009). In vitro had Arixta echter weinig effect op de productie van TNF-α. Ook de productie van TGF-β veranderde niet als Arixta werd toegevoegd aan het kweekmedium. Het effect van Arixta is mogelijk niet alleen zozeer via remming van de ontstekingsreactie. Uit onderzoek van Borensztajn et al (Factor Xa Stimulates Proinflammatory and Profibrotic Responses in Fibroblasts via Protease-Activated Receptor-2 Activation.” Am J Pathol 2008) is in vitro gebleken dat factor Xa zelf in staat is om myofibroblast differentiatie te induceren. Verder onderzoek naar het werkingsmechanisme van Arixta kan in het vervolg onderzoek worden uitgevoerd.
Gezien de eerdere gunstige resultaten met celecoxib in het peritoneale dialyse model (deels vermindering ontsteking en fibrose: Fabbrini, Scilte, Zareie, Wee, Keuning, Born, Beelen: Celecoxib largely prevents pertoneal worsening in experimental peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transpl 2009, in press) hadden wij hoge verwachtingen van deze stof op de wondgenezing. Celecoxib werd gedurende 2 weken oraal toegediend in dezelfde dosis. Helaas werd er geen enkel significant effect gemeten.. Zowel de influx van ontstekingscellen als myofibroblasten was niet veranderd. De uitgroei van het epitheel was ook hetzelfde evenals de wondcontractie na 6 weken. Er waren ook geen verschillen in littekenweefsel. In vitro had Celecoxib ook geen significant effect op de TGF-β productie door LPS gestimuleerd monocyten. Door tijdgebrek zijn er verder geen ELISA’s voor IL-1, Il-6 en TNF-α uitgevoerd. Al met al (ook al door omstreden bijeffecten) lijkt celecoxib dus ook minder geschikt.